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1、1第五部分目录胚胎实验室手册胚胎实验室工作规程 1无菌技术 2设备校准和维护 3实验室质控 5实验室工作流程 6培养液的配置 7取精和精液分析 8精子处理 9精子冷冻和解冻 10取卵和卵子处理 10IVF 的授精 11单精子卵胞浆内注射(ICSI) 13胚胎的培养和观察 13囊胚培养 14胚胎移植 15胚胎冷冻和解冻 17辅助孵化 19胚胎着床前诊断(PGD)操作 19实验室人员的职业安全 20病人身份和标本标识 212实验室记录及保密21冻存标本22卵子的捐赠22事故和问题22耗材和管理23设备清单23消耗品清单24试剂清单25手术、实验室温度、湿度、通风25胚胎实验室工作制度实验室人员职责
2、27实验室人员工作制度27实验室物品管理制度 28实验室仪器维护制度 28实验室消毒隔离制度 28实验室工作程序 293第一部分 实验室质控实验室质控是辅助生殖技术成功的关键。水、培养液、一次性用品、PVP、试剂、矿物油、混合气体的质量和实验室环境的改变可导致配子和胚胎的发育能力降低。质控应能在问题出现之前检测出潜在的问题，当检测到问题时应立即采取措施进行纠正。程序和消耗品在没有评估和权威认可时不能随意更改。一、无菌技术无菌环境对任何细胞培养的成功都是至关重要的。通常采用的方式是使用垂直层流的超净工作台。工作原理：无菌气流的方向为由上而下的。位于无菌气流中的无菌物品可保持无菌，其上方无其他物体
3、的遮盖。操作要点： 确定无菌和非无菌物，分开放置，不将非无菌物放在无菌物上方 无菌物应暴露在无菌空气中 所有无菌操作必须在无菌环境中完成 移液时不要过早打开盖子，将盖子放在工作台的后方，内面朝上，并避免在其上方操作 所有移液管、移液头的前端均不可置于操净台外，应朝向内放置 每天工作结束后用消毒蒸馏水擦拭超净台4二、设备校准和维护1. 常规检查和校准项目 温度 允许温差 C02 浓度 允许浓度差C02 培养箱 37 C0 0.5 C0 50 05倒置显微镜恒温载物台 37 C0 0.5 C0 / /恒温平台与恒温试管架 37 C0 0.5 C0 / /冰箱 保鲜层 6 C0 2 C0 / /冻臧
4、层 12 C0 2 C0 / /2.要求： 每日晨同一时间用标准的 C02 检测仪、温度计来检测 C02 培养箱内的温度C02 浓度。 温度和 CO浓度超出设定的界限应向上级汇报，及时处理。 每日结果记录在质控记录本3. 一般维护项目 时间 维护C02 培养箱 每月一次 清洁消毒污染 清洁消毒必要时 由供应商保养、再校准恒温平台与恒温试管架 每周一次 清洁每月一次 消毒5超净工作台 每周一次 清洁必要时 消毒去污离心机 每月一次 清沽消毒倒置显微镜与体视镜 使用后 清洁必要时 由供应商保养、校准微量移液器 每周一次 清洁消毒每三个月 送测定所校准冰箱 每周一次 清洁建有专项记录，每次清洁维护予
5、以记录。4. 具体清洁消毒方法4.1 时间安排:每天 清洁倒置显微镜、体视镜、超净工作台、工作区域每周 清洁 C02 培养箱的水托盘，换水每月 清洁消毒离心机、恒温平台、恒温试管架、清洁培养箱4.2 清洁方法：4.2.1 超净工作台：用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干4.2.2 倒置显微镜、体视镜：用消毒蒸馏水擦洗表面后擦干4.2.3 C02 培养箱水托盘：把培养箱内物品拿出后取出托盘把水到掉，用沸水冲洗浸泡后用无菌纱布擦干，放回培养箱，倒入无菌蒸馏水至 34 处，待温度和 CO2 浓度平衡后使用4.2.4 离心机：将吊桶从转轴中取出，用洗洁精刷洗后在流水下冲净后用675酒精擦拭。用洗洁精、水、75酒
6、精依次擦洗.后重新装回吊桶4.2.5 恒温平台与恒温试管架：从实验室取出，依次用水、75酒精、水擦洗，试管架内管用长棉签擦拭，放回室内，装好4.2.6 试管架：浸泡在洗洁精溶液中用刷子擦洗，在水龙头下冲洗，用 75酒精擦拭后置于通风处下燥4.2.7 CO2 培养箱：把箱内物品取出后拆除内部所有隔板，用沸水冲洗水托盘和隔板后用无菌纱布擦干。用无菌蒸馏水擦拭培养箱内壁及玻璃门。将水托盘放回培养箱，倒入新鲜的无菌蒸馏水，将隔扳重新放回培养箱内，待温度和 C02 浓度达到平衡后使用4.2.8 各种硅胶管：用酒精浸泡 30 分钟，用无菌蒸馏水内外冲洗 20 秒，用无菌蒸馏水浸泡过夜后再用无菌蒸馏水内外冲
7、洗 20 秒，将管腔内的水分排干。5. 剥离管和移液管的准备和消毒：用经过灭菌和鼠胚实验合格的巴氏吸管。两手握住巴氏吸管的两端，将吸管窄部中央在酒精灯的火焰中烧软，移离火焰后迅速向两边牵拉，形成细长的玻璃管。用火焰将细管在合适直径处烧断，将弃去的断头在火上烧热，在留下的玻璃管中选择合适直径处烫断。在体视镜下检查其直径应为 140160um(剥离管)或 160180um(转移管)。7三、C02 的检测和消耗品检测方 法：精子存活实验用 物：被检测过的培养液和矿物油消耗品，有来自以前受试供者的精液准 备：收集实验当天的精液，液化后用梯度法洗涤后放在无菌离心管中。C02 监测：每个培养箱中各放两个精
8、子培养管，并将培养管盖子松开，培养三天新消耗品检测：将新消耗品在适量的培养液中充分暴露，用此培养液与培养器皿收集和培养精子三天。取 样：用移液管混合标本 30 次后取 20ul 精子放入载玻片，在镜下观察，计数 200 条精子的活力后除 2 即为最后结果，同一标本重复计数的误差应在10之内。记 数：记录精子最初的浓度、活动力和活动分级，记数培养后精子的活动力和活动分级。结 果：在第三天精子活动率减少 20以上提示有毒性物质存在。临界结果需重新测试。实验室定期评估项目 间隔时间 标准受精率 2 周 60卵裂率 2 周 90种植率 1 个月 1 0A 级胚胎比率 2 周 20冷冻胚胎解冻复苏率 1
9、 个月 708当发现妊娠率下降时，应检测一些潜在可能影响因素，发现后予以纠正。可能的影响1. 临床改变2. 空气质量3. 实验室清洁工作4. 气体供给和气体质量5. 实验耗材批号改变：矿物油6. 培养箱的校准和稳定性7. 消耗品的改变9实验室工作流程上 午打开设备电源，开启恒温设备检查 C02 气体，C02 培养箱的温度和 C02 浓度，并记录观察室内温湿度并记录准备当日的培养液和消耗品检查前一日的 IVF 或 ICSI 受精情况检查受精卵的发育情况取卵，精液处理IVF 或 ICSI下 午胚胎冷冻配置培养液准备消耗品将第二天所需的培养皿放入 C02 培养箱关掉设备电源清洁设备、工作区域取换垃圾
10、桶 关闭实验室不用的电源培养液的配制10 取卵液(HTFHEPES+HAP)：用于冲洗取卵针、收集卵子。含 97HTFHEPES、3HAS、1肝素。 洗卵液(HTF HEPES)：用于卵丘复合物和卵子的暂时存放。含 97HTFHEPES、3HSA。移植液(ET)：用于胚胎移植和注射、打孔盘的制作。含 90ttTPHEPES、I0HSA。 培养液(IVCONE)：用于卵子、配子及卵裂球的培养。含 85 90IVCONE、15 一 I0HSA。 囊胚培养液(VCFHREE)：用于胚胎囊胚期的培养。含 890IVC THREE、15 一 I0HSA。 80分层油：用于精液的洗涤处理。含 80分层油、
11、20沈卵液。 40分层油：用于精液的洗涤处理。含 40分层油、60取卵液。 透明质酸酶(HY)HY 的终浓度为 80100IUML称量 0026g 的透明质酸酶溶于 10ml 新鲜配置的洗卵液，用 04Sum的针筒式过滤器过滤后，每 25m1 分装于 5ml 的试管中，冷冻保存。 聚碘维酮(PVP)PVP 的终浓度为 10称量 05g 的聚碘维酮溶于 5ml 新鲜配置的洗卵液，在室温下静置 4小时后用 04Sum 的针筒式过滤器过滤，每 04m1 分装在 1ml 的离心管中，冷冻保存。 培养油的制备目前我中心所用的培养油是 SIGMA 公司的 M8410 矿物油。此类矿物油11已经过灭菌消毒，
12、但用前还要经过处理。洗油：将矿物油和 HTFHEPES 按 9：l 的比例倒入玻璃质的无菌容器中，摇动瓶子，使液体与油充分混匀。静置于冰箱保鲜层内 3 天(最长不可超过 7 灭)，使油与液体自然分层。滤油：自然分层后，将上层油置用 045um 针筒式过滤器过滤在 250ml 或600ml 培养瓶中，置于冰箱保鲜层中保存。平衡：用时须至少提前 3 天分装于 50ml 培养瓶中，松开瓶盖置于于 C02 培养箱中，平衡后方可使用。取精和精液分析 取精应在取卵于术前(1CSI、IVF)或授精的(IUI)2 小时进行。 核对病人姓名、病历、身份证后给病人一个取精杯，杯身上要有明确标示。 如取精困难，则通知男科医生，考虑通过外科手术睾丸取精。 尽量要求病人在中心取精，在外取精者需在 30 分钟内送回。精液分析正常
