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1、探究葱生长对干旱环境的响应一 研究目的水资源不足已经成为世界主要的农业产区都存在的问题1,我国作为一个缺水的国家，干旱不仅制约着经济的发展，同时还导致了一系列的环境生态问题2干旱作为一种主要的非生物胁迫因子，它限制着农作物的生长，因此研究植物的抗旱性对植物学的研究以及农业生产都有着重要的指导意义。葱在东亚国家以及各处华人地区中，常作为一种很普遍的香料调味品或蔬菜食用，在人们的饮食生活中占有一部分的地位，它的生长受到各种因素的影响，水分因子是葱生长环境最易改变也最易人为控制的因子，在胁迫状态下保持最佳的水分状态对葱生长是至关重要的。葱的最终产量来源于光能的截获和同化以及光合产物在体内的分配，结合
2、现有的试验条件我们通过观察测量种子的萌发率，根的长度、颜色变化，叶子气孔的大小和数量，叶子的颜色、枯败，以及测量植株体内的可溶性糖，脯氨酸，叶绿素 a,叶绿素 b 的含量，丙二醛的含量来了解干旱对葱生长的影响。本研究通过溶液培养试验设置不同程度的干旱探究对葱的生长过程中的生理生化以及形态的影响，以便为葱的种植提供一定试验依据。三 试验材料种子：葱 实验仪器：直尺，放大镜，培养箱，可见光分光光度计；低速离心机；恒温水浴锅；旋涡仪；天平；剪刀；漏斗；研钵；培养皿（21 个）烧杯；移液管；容量瓶；具塞试管；人造沸石；显微镜；实验试剂：冰醋酸；甲苯，3%磺基水杨酸；0、0.1、0.2、0.3、0.4、
3、0.5、0.6mol/L 甘露醇；标准的脯氨酸溶液；酸性茚三酮试剂；活性炭；乙醇；葡萄糖标准液；蒽酮试剂*试剂的配制：1 0.3mol/L 甘露醇：54.65g 甘露醇溶于 1000ml的蒸馏水；2 标准的脯氨酸溶液： 10脯氨酸溶于 100ml80%乙醇中，质量浓度为 100 微克每毫升；3 酸性茚三酮试剂：2.5g 的茚三酮置于 60ml 冰醋酸和 40ml 6mol/L 磷酸，加热（70）溶解，试剂 24h内稳定；4 葡萄糖标准液：称取已经在 80烘箱中烘至恒重的的葡萄糖 100mg，用 80%乙醇配制成 1000ml 溶液，即得每 ml 含糖 100 微克的标准溶液5 蒽酮试剂：称取
4、1g 蒽酮，溶解于 1000ml 稀硫酸（将 760ml 相对密度为 1.84 的浓硫酸用蒸馏水稀释到 1000ml）溶液，置于棕色的瓶子里面，当日配置使用。四 实验原理在实验过程中采用蒽酮法测量可溶性糖的含量，糖在浓硫酸的作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮反应形成绿色络合物，颜色的深浅与糖含量有关，在 625nm 波长下的 OD 值与糖的含量成正比。在酸性和高温的条件下，丙二醛可与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成棕红色的 3,5,5-三甲基噁唑-2,4-二酮，在 532nm 处有最大吸收波长，但该反应会受到可溶性糖的极大干扰，糖与 TBA的反应产物在 532nm 处也有吸收，但是最大的吸收波在 45
5、0nm处，采用双组分光光度法可分别求出 MDA 和可溶性糖的含量。五 试验步骤1. 在 7 个培养皿中分别放入 10ml 不同浓度的甘露醇溶液（使得滤纸浸湿）并编号，试验设置 5 个平行（A、B、C、D、E）（见图表 1） ；2 取葱的种子播于铺有湿滤纸的培养皿中培养并将其置于 4培养箱。分别在不同浓度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0nol/L）的培养基（底部放有滤纸）放入 20 粒种子，胚根突破种皮视为萌发，观察种子的萌发率；（A 组用于观察和测量根的长度，其它 4 组进行后续试验）33.在种子生长的过程中观察植株的生长状况（叶子的颜色，植株的
6、高矮，根的长度，颜色） ，并一一记录，每隔 3 天记录一次，每隔 5 天加一次培养液，20 天后每隔 3 天采取每个培养皿中植株相同部位的叶子进行显微观察比较它们的气孔的大小和多少以及脯氨酸、叶绿素 a,叶绿素 b 的含量，可溶性糖以及丙二醛；（试验方法见下文）甘露醇浓度（mol/l）组别0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0ABCDE图（1）（一）脯氨酸含量的测定【4】 【5】1. 取地上部（芽鞘和叶子）0.5g，用 3%磺基水杨酸 5ml 研磨提取，匀浆移入离心管中，在沸水中提取 10mim，冷却后，3000r/mim 离心 10mim，取上清液
7、待测；2. 制作标准曲线：用 100 微克每毫升脯氨酸配制成0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 微克每毫升的标准溶液，取标准溶液各 2ml，加 2ml3%磺基水杨酸、2ml 冰醋酸和 4ml2.5%酸性茚三酮试剂于具塞试管中，置于费水浴中显色 1h，冷去后加入 4ml 的甲苯，盖好盖子于旋涡混合仪上振荡 0.5mim，静置分层，吸取红色的甲苯相，于波长520nm 处测定 OD 值，以 OD 值作为纵坐标，脯氨酸质量浓度（微克每毫升）为横坐标绘制标准曲线图3. 各取 2ml 上清液，分别加入 2ml 蒸馏水， 2ml 冰醋酸，4ml2.5%酸性茚三酮试剂，与上述做标准曲线一样经行显色、
8、萃取、比色，最后从标准曲线上查的脯氨酸的含量（二）叶绿素 a,叶绿素 b 含量的测定【6】1. 色素的提取：取新鲜的叶片，称取 0.5g 放入研磨中并加入纯丙酮 5ml，少许的碳酸钙和石英砂，研磨成均浆，再加80%丙酮 5ml，将均浆转入离心管呢，并用适量的 80%的丙酮洗涤研磨，一并转入离心管，离心后弃沉淀，上清液用 80%的丙酮定容至 20ml;2.测定 OD 值 去上述色素提取液 1ml，加 80%丙酮 4ml 稀释后转入比色杯中，以 80%的丙酮作为对照，分别测定在663nm、645nm 处的 OD 值；3 计算：依据 Lambert-Beer 定律（三）可溶性糖的测定789 1.可溶
9、性糖的提取 植物的叶片或种子在 110烘箱烘15min，然后调至 70 过夜，干叶片磨碎后称取 50mg 样品倒入10ml 刻度离心管内加入 4ml80%乙醇，置于 80水浴中不断地搅拌 40min，收集上清液，其残渣加入 2ml80%乙醇重复提取 2 次，合并上清液。在上清液中加入 10mg 的活性炭，80脱色30min，80%乙醇定容至 10ml，过滤后取滤液测定；2绘制标准曲线 取 20ml 带试管塞，编号，按下表配置系列浓度的葡萄糖标准溶液，然后在每支试管中加入 5ml 的蒽酮试剂，混匀，盖上盖子，在沸水浴中煮沸 10min（水浴重沸后计时） ，取出，立即用水冷却至室温，在 625nm
10、 的波长下，分别测量个管的 OD 值，用 0 号管调零。以 OD 值做为纵坐标，葡萄糖的含量作为纵坐标，绘制标准曲线管号 0 1 2 3 4 5 6葡萄糖标准液体积/ml0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.080%乙醇体积/ml 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0葡糖糖含量/ml 0 10 20 40 60 80 1003. 测定 吸取上述糖提取液 1ml，加入 5,ml 的蒽酮试剂混合，用上述同样的方法在 625nm 处测得 OD 值，以 0 号管调零，由标准曲线查得葡糖糖含量，然后根据每 ml 提取液含有 5mg 干样品中的糖，再行计算样品中的糖含量。（四）丙二
11、醛（MDA）含量的测定 1011121MDA 的提取 盆栽小麦在进行干旱处理后，在每一个的培养皿中植株的相同部位取相同数量的叶子（1.000g）将其剪碎，加入 10%三氯乙酸（TCA）2ml 和少量的石英砂，研磨；在进一步加入 8mlTCA 充分研磨，均浆以 4000g 离心 10min，上清液即为样品提取液；2 显色反应以及测定 吸取 2ml 的提取液，加入2ml0.6%TBA 液，混匀，在试管上加塞盖，置于沸水浴中沸煮15min，迅速冷却，离心。取上清液测定 532nm 和 450nm 处的 OD值，对照管以 2ml 的水代替提取液；3 计算 MDA 与 TBA 反应产物的最大吸收峰在53
12、2nm，TBA 可与可溶性糖的反应产物的最大吸收峰在 450nm，吸收曲线彼此又有重叠，根据 Lambert-Beer 定律，可以计算出样品提取液中 MDA 的含量，然后再计算出每克样品中 MDA 的含量六 参考文献 1 王智威 2013 水分胁迫下玉米苗期的生长及生理响应2 马旭凤 2010.水分亏缺对玉米生理指标、形态特征以及解剖结构的影响【硕士学位论文】 。杨凌：西北农林科技大学3 田美华，唐安军，宋松泉.温度和渗透胁迫对细叶鸦葱种子萌发的影响.云南植物研究 2007，29（6） ；6826864 於琍 2001 不同条件下冬小麦干物质积累及分配规律的研究5 张殿中，等.测定小麦叶片游离
13、脯氨酸含量的方法.植物生理学通讯，1990， （4）：6265.6 什小南，等.水分胁迫对植物线粒体结构和脯氨酸氧化酶活性的影响。植物生理学报，1986，,（4）：388395.7 杨善元.关于测定叶绿素含量及 a:b 值等若干问题.植物生理学通讯，1983， （4）：6162. 8 李如亮，生物化学实验.武汉：武汉大学出版社，1998.8.9 吴青君，龚佑辉，等，花蓟马主要寄主植物可溶性糖和蛋白质含量的测定，2007（10）：2022.10 国卫生检验杂志 2006 年 6 月 第 6 期11 胡文玉，等.提取植物体内的 MDA 溶剂作为衰老指标的探讨，植物生理学通讯，1991,27（1）：44 46.12 徐长城，邹琦，等.植物组织中丙二醛测定方法的改进植物生理学通讯，1994,30（3）：207 210.13 苍晶，徐忠，郝再彬.植物生理学实验【M】.哈尔滨.哈尔滨工业大学出版.2004.
