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1、第七章 细胞培养植物组织培养探索阶段（1902-1929 年）Haberlandt：观点：高等植物的组织和器官可以分割成单个细胞首次进行离体细胞培养 小野芝麻和凤眼兰的栅栏细胞和虎眼万年青属表皮细胞关于单离植物细胞培养实验我愿意指出：在我的培养实验中，虽然经常观察到细胞的明显生长，但从未观察到细胞分裂。发现单细胞培养的条件，将是未来培养试验的难题。 意义 1. 建立单细胞无性系。2. 对培养的单细胞进行人工诱发突变。3. 排除体细胞干扰。4. 遗传转化受体的建立一、单细胞的分离1、由完整的植物器官分离单细胞 （1）机械法 方法：用解剖刀刮取。 研碎，过滤和离心特点：细胞不受酶的伤害 无须质壁分
2、离（2）酶解法 方法：果胶酶等 特点：可获得单纯的材料2. 由培养组织中分离单细胞愈伤组织游离细胞 悬浮培养物二、悬浮培养1.培养类型 2.悬浮培养条件 3.细胞生长的计量 4.细胞活力的测定（一）细胞培养过程：1. 择适宜的外植体；2. 诱导疏松愈伤组织；3. 选择适宜的培养基；4. 悬浮培养；5. 悬浮细胞的继代与选择；6. 悬浮细胞的同步化；7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。 （二）优良悬浮培养体系要求：A. 悬浮培养物分散性好，细胞团较小，一般由几十个以下的细胞组成。B. 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。C. 生长迅速，悬浮细胞的量一般 23 天甚至更短时间便可增加一倍。三、细
3、胞培养的特性：1. 植物细胞较微生物细胞大，具有纤维素细胞壁，抗剪切力差；2. 细胞生长速度慢，易受微生物污染，有时需用抗生素；3. 细胞生长的中期及对数期，易凝聚为直径达 350 um 一 400 um 的团块，悬浮培养较困难；4. 培养时需供氧，培养液粘度大，不能耐受强力通风搅拌；并具有群体效应5. 培养细胞产物滞留于细胞内，且产量较低，培养过程具有结构与功能全能性。悬浮培养 指将游离的植物细胞，按照一定的细胞密度，悬浮在液体中进行培养的一种方式。培养目的建立单细胞培养物1.培养类型（1）分批培养 指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养。特点： 除气体和挥发性代谢物外，其它都是密闭的 细
4、胞生长呈 S 形曲线 需要不断继代（2） 连续培养 利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的方式。特点：培养基的容积恒定。为封闭型和开放型 封闭型 排除的旧培养基由加入的新培养基补充。特点：进出数量保持平衡 胞数目不断增加 开放型 注入的新鲜培养液的容积与流出的原有培养液及其中的细胞的相等 特点：细胞数量相等。 。 。 。长速度保持在高的恒定水平。分为化学恒定式和浊度恒定式2.悬浮培养条件（1）培养基基本培养基 B5 和 ER 培养基，磷酸盐激素 生长快、易散碎的愈伤组织（2）培养物的振荡旋转式摇床转床（3）培养细胞的同步化 培养中的大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段。方法: 饥饿法停止供
5、应所需的营养成分等 抑制法: 加入 DNA 合成抑制剂细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。抑制剂法：通过一些 DNA 合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在 DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期G1 期的同步化细胞。低温法：冷处理也可提高
6、培养体系中细胞同步化程度。3.细胞生长的计量 （1）细胞计数（2）细胞进密实体积（3）细胞鲜重（4）细胞干重 4.细胞活力的测定 （1）相差显微术法（ 2）四唑盐还原法 TTC（3）二乙酸荧光素法 FDA（4）伊凡蓝染色法 四、单细胞培养1.单细胞培养方法 1）平板培养法 将悬浮液接种在薄层固体培养基上的方式 点：便于在显微镜下连续观察（2）微室培养 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基的方法。特点： 能观察细胞团形成的全过程 细胞只能短期分裂（3）看护培养 用一块愈伤组织（或花药）来看护细胞的培养方法。特点： 方法简便 不便观察细胞的分裂和细胞团的形成2.单细胞培养程序 （1）
7、建立细胞株（2）高产细胞株的选择（3）分化培养和扩大培养（4）鉴定和提取（ 1）建立细胞株 细胞株：来自一个单细胞的细胞团。 材料选取 选择易于分散的花粉 选择分散性好的愈伤组织质地坚实愈伤组织疏松易碎从叶肉、根尖、髓组织取材 悬浮细胞液的制备 液体培养基 不锈钢网过滤；再离心过滤（2） 高产细胞株的选择 平板培养 鉴定和测定 培养目的（3）分化培养和扩大培养 分化培养 选育新种 细胞团分化完整植株的培养扩大培养 提取生化产物 细胞株的继续增殖的培养。（4）鉴定和提取3.单细胞培养的技术关键（1）细胞的起始密度细胞密度 单位：个/ml 指单位体积内的细胞数目。或每毫升培养液中含多少个细胞。起始
8、密度（最低有效密度）指开始培养时，单位体积内的细胞数目。或使细胞分裂、增殖的最低接种量。 不同培养方式 悬浮培养 (0.5-2.5)105 个细胞/ml 平板培养 用植板率衡量植板率：在平板上形成细胞团的百分率。 不同植物种类2. 培养周期 培养周期 指具有一定起始密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增大停止这一过程。S 形曲线培养时间细胞数 延迟期 直线生长期（对数生长期） 减缓期 静止期特点 延迟期 细胞很少分裂或刚刚开始分裂 直线生长期 细胞数目迅速增长，生长速率保持不变 减缓期 细胞数目的增长速率减缓 静止期 细胞分裂停止，细胞数目恒定3.培养基条件 基本培养基 需更高的硝态氮和
9、铵态氮的量 植物激素和其他附加成分 酸碱度 加入固态缓冲物 磷酸氢钙、磷酸钙和碳酸钙专题研究 中草药植物中含有数量极为可观的次代谢物质。据保守的估计，目前已发现的植物天然代谢物已超过 2 万种，而且还在以每年新发现 1600 种的速度递增。我们祖先在与疾病的抗争中已各积累了丰富的利用植物中的生物活性物质治病强身的经验。李时珍（1953）编纂的巨著本草纲目中所开列的 1892 种药物绝大多数是植物。目前仍约 25%的法定药品来自植物。然而植物生长缦慢，自然灾害频繁。即使是大规模人工栽培仍然不能从根本上满足人类对经济植物日益增长的需求。因此早在 1956 年，Routier 和 Nickell 就
10、提出工业化培养植物细胞以提取其天然产物的大胆设想。Reinhard 等（1968）首先将这种设想转变成现实，生产出了哈尔碱(harmine)。紧接着 Kaul 等（1969） 、Furrya 等(1972)和 Teuscher 等（ 1973）分别培养植物细胞获取了其中的薯蓣(yu 山药）皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin） 。现在一些发达国家已集中相当数量的人力、财力潜心开拓这个经济潜力十分巨大的生产领域。目前世界最大批量工业化培养细胞（烟草细胞）已达 2 万升（20 吨） 。我国在“八五”、 “九五”和“863 计划”中连续拨款资助工业化培养红豆杉细胞生产抗肿瘤药物紫杉醇的研究，
11、目前已达到 60mg/L 的世界先进水平。植物细胞培养是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。 鉴于有些产物的唯一来源只能是植物，而许多有价值的植物只能生长在某一特定的地理区域，且受到很多自然条件的限制和影响，尤其是有些植物从种植到收获要花几年时间，很难满足需要。采用大规模植物细胞培养技术就可以直接生产这些产物。如可作为药物和染料的紫草宁就是典型的通过大规模植物细胞培养生产的产品，通过大规模培养紫草细胞短时间内就可大量生产紫草宁。表 12-1 是植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较。 请
12、列举出 3 至 5 种由大规模培养植物细胞获得的有经剂价值的产物。抗肿瘤药物紫杉醇 紫草宁薯蓣皂苷、人参皂角苷和维斯纳精（visnagin）三、植物细胞的大规模培养技术 目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。 前者适于大量快速地增殖细胞，但往往不利于次生物质的积累；后者则相反，细胞生长缓慢而次生物质含量相对较高。2、植物细胞或原生质体的固定化培养：胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。其前提就是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。由于固定化植物细胞培养比自由悬浮细胞培养具有较高的机械稳定性、产率，更长的稳定（生产期）等许多
13、优点，因此，通常采用固定化来进行植物细胞的培养。这类培养包括了植物细胞和原生质体的固定化培养。植物细胞固定化的常用方法有哪些？海藻细胞的固定化 针对上述细胞悬浮培养的缺点，Brodelius 等（1979）首次报道了用海藻酸钙成功固定培养橘叶鸡眼藤、长春花、希腊毛地黄细胞。实验证明，细胞分化和次生物质积累之间存在正相关性。细胞固定化后的密集而缓慢的生长有利细胞的分化和组织化，从而有利于次生物质的合成。此外，细胞固定化后不仅便于对环境因子的参数进行调控，而且有利于在细胞团间形成各种化学物质和物理因素的梯度，这可能是调控高产次生物质的关键。 为什么说植物细胞固定化培养更有利于次生生物的生成？以下简
14、要介绍褐藻钙固定植物细胞的技术路线：大量培养植物细胞混合 倒入塑料注射器 慢慢滴入含氯化钙的培养基一定浓度的海藻酸钠溶液海藻酸钙固定的细胞团小规模固定化小规模的植物细胞固定化可用无菌的塑料注射器进行。配制一定浓度的海藻酸钠溶液，高温、高压灭菌。通过离心或过滤收集植物细胞，将细胞悬浮于海藻酸钠溶液混合，倒入塑料注射器中，慢慢滴入到含有 CaCl2 的培养基中，不断搅拌，使之形成球形颗粒，然后通过过滤收集颗粒，用含有 CaCl2 的培养基清洗后，转入装有培养基的摇瓶中进行培养。问题 1、用卡拉胶固定化植物细胞方法有哪些？2、琼脂糖固定化和琼脂固定化的最大优点是什么？3、在植物细胞固定化的四种方法，
15、哪些方法需要其它离子来保持胶的稳定性？分别用什么离子？原生质体的固定化由于原生质体比完整的细胞更脆弱，因此，只能采用最温和的固定化方法进行固定化。通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。 总之，人类迄今通过植物细胞培养获得的生物碱、维生素、色素、抗生素以及抗肿瘤药物不下 50 多个大类，其中已有 30 多种次生物质的含量在人工培养时已达到或超过亲本植物的水平。在已研究过的 200 多种植物细胞培养物中，已发现可产生 300 余种对人类有用的成份，其中不乏临床上广为应用的重要药物。利用培养植物细胞工厂化生产生物天然次级代谢产物的美好前景已经十分清楚地展现在我们面前。深入发掘我国特有的巨大中
16、草药宝库，结合现代细胞培养技术，我国植物细胞次生物质的研制与生产一定会硕果累累，后来居上。五、植物细胞培养反应器 植物细胞培养用的反应器主要有 机械式搅拌生物反应器、鼓泡塔与气升式生物反应器、填充床式生物反应器、流化床生物反应器和膜式生物反应器 等。 1、机械式搅拌生物反应器 (P234) 2、鼓泡塔与气升式生物反应器 (P234) 3、填充床生物反应器 填充床生物反应器的优点在于单位体积固定细胞量大，但是填充床反应器还存在许多缺点，它的混合效果低，对必要的氧传递、PH、温度控制和气体产物的排除造成了困难，影响了细胞的培养，同时大颗粒的低效率传质、填充体成分供应和排除的困难，限制了填充床反应器应用于不要求细胞活
