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1、生物化学实验讲义实验一 蛋白质的性质实验蛋白质及氨基酸的呈色反应及蛋白质的沉淀反应实验目的1了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。2了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。3学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。4加深对蛋白质溶液的胶体性质的认识，了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 ，一、茚三酮反应1.实验原理除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有 氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。-丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基
2、酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，11 500 000 浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH 3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。此反应的适宜 pH 为 57，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同 pH 条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。2.材料、仪器与试剂蛋白质溶液；新鲜鸡蛋清溶液（蛋清水=19） ；0.5%甘氨酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液3.实验操作取 2 支试管分别加入鸡蛋清
3、溶液和 0.5%甘氨酸溶液 1ml，再各加 0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热 12 分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。在一小块滤纸上滴一滴 0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。二、黄色反应1.实验原理含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液；大豆提取液(将大豆浸泡充分吸胀后，研磨成浆状用纱布过滤)；
4、头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液3.实验操作向 7 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。管 号 1 2 3 4 5 6 7材 料（滴）鸡蛋清溶液4指甲少许头发少许0.3%色氨酸40.3%酪氨酸4浓硝酸/（滴） 2 4 40 40 4 4 4现象三、蛋白质沉淀反应蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶性盐类后，即自溶液中沉淀析出，此现象叫蛋白质的沉淀反应。（一）蛋白质的盐析作用1.实验原理盐
5、析现象是指般蛋白质在高浓度盐溶液中溶解度下降，故向其溶液中加入中性盐至一定浓度时，蛋白质即自溶液中沉淀析出。盐 析作用与两种因素有关： 蛋白质分子被浓盐脱水； 分子所带电荷被中和。蛋白质的盐析作用是可逆过程，用盐析方法沉淀蛋白质时，较少引起蛋白质变性，经透析或用水稀释时又可溶解。盐析不同的蛋白质所需中性盐浓度与蛋白质种类及 pH 有关。分子量大的蛋白质(如球蛋白)比分子量小的(如清蛋白)易于析出。球蛋白在半饱和硫酸铵溶液中即可析出，而清蛋白需在饱和硫酸铵溶液中才能析出。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清水=19） ；固体硫酸铵；饱和硫酸铵溶（ 称取377 g硫酸铵溶于20500ml 的蒸馏水
6、中。硫酸铵在20水中的溶解度为754g/L水。配制时需称取稍过量的硫酸铵使溶液中有少量固体存在，同时可加热助溶） 。3.实验操作取鸡蛋清溶液约 5ml 于试管中，再加入等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静止数分钟则析出球蛋白沉淀。将管内混合液过滤，向滤液中加入硫酸铵粉末，至硫酸铵饱和不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。（二）重金属盐类沉淀蛋白质1.实验原理溶液 pH 在蛋白质等电点以上时，重金属盐类(如 Pb 2+ 、Cu 2+ 、Hg 2+ 及 Ag + 等)易与蛋白质结合成不溶性盐而沉淀。重金属盐类沉淀蛋白质通常比较完全，故常用重金属盐除去液体中的蛋白质。但应注意，在使用某些重金属盐(如硫酸铜
7、或醋酸铅)沉淀蛋白质时，不可过量，否则将引起沉淀再溶解。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清水=19） ；5CuS04 溶液；3AgNO3 溶液3.实验操作取试管 2 支各加蛋白质溶液 1ml，向各管分别滴加 2-3滴加 5CuS04 溶液、3AgNO3 溶液，观察各管所生成的沉淀。在硫酸铜产生蛋白质沉淀的试管中，倒掉大部分沉淀，留少量沉淀，继续加入 5CuS04 溶液，观察沉淀的溶解。（三）有机酸沉淀蛋白质1.实验原理生物碱是植物中具有显著生理作用的类含氮的碱性物质。凡能使生物碱沉淀，或能与生物碱作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。如鞣酸、苦味酸和磷钨酸等。当蛋白质溶液 pH 值低于其等
8、电点时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合成中性盐而沉淀。溶液中的蛋白亦能被有机酸沉淀，其中以三氯醋酸的作用最为灵敏而且特异，因此广泛的被用于沉淀蛋白质。2.材料、仪器与试剂鸡蛋清溶液（蛋清水=19） ；10三氯醋酸溶液； 3.实验操作取蛋白质溶液 1ml 于试管中，加数滴三氯醋酸溶液，观察现象。思考题 1茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？并说明原因。2能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？3哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？实验二 考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量【实验目的】蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担
9、着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G-250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝 G-250 存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝 G-250 在酸性游离
10、状态下呈棕红色，最大光吸收在 465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在 595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm 处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm 处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝 G-250 结合，在 2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下 1 小时内保持稳定。蛋白质- 染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。【实验试剂和器材】1.仪器电子天平、试管、试管架、移液管、容量瓶、721 型分光光度剂2.试剂 （1）标准蛋白质溶液：称取
11、10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100mL，制成100g/mL 牛血清白蛋白溶液（2）考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50mL90%乙醇中，加入 85%的磷酸 100mL，最后用蒸馏水定容到 1000mL。（3）鸡蛋清 1ml 定容至 50mL【实验步骤】1、标准曲线绘制取 6 支试管，按下表加入各试剂。管号试剂 0 1 2 3 4 5100g/mL 牛血清白蛋白溶液 mL 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0蒸馏水mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝液mL 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
12、蛋白质含量/g 0 20 40 60 80 100加入考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂后，摇匀，放置 2min 后，在 595nm 波长下比色测定，记录 A595。以各管相应标准蛋白质含量（ mg）为横坐标、 A595 为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品测定试管中加自制蛋白质样品 1.0mL ，再加入 5.0mL 考马斯亮蓝 G-250 试剂，摇匀，放置 5min 后，在 595nm 波长下比色，记录 A595。根据所测 A595 从标准曲线上查得蛋白质含量。【实验结果】根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（g） ，按下式计算：查得的蛋白质含量（g）提取液总体积（mL ）
13、样品蛋白质含量（g/g 鲜重） =样品鲜重（g）测定时取用的提取液体积（mL）【注意事项】（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的 520min 内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在 1h 内完成。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。实验三 氨基酸的分离鉴定纸层析法【实验目的】通过对氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。【实验原理】层析法又称色谱法。1903 年，发现用挥发油冲洗菊粉柱时，可将叶子的色素分成许多颜色的层圈。此后，把这种利用有色物质在吸附剂上因吸附
14、能力不同而得到分离的方法称为色谱法（Chromatography） 。虽然后来将色谱法应用于无色物质分离，但是这个名字一直沿用下来。层析法除了吸附层析以外，还有离子交换层析和分配层析。一般认为纸层析是分配层析中的一种，但也并存着吸附和离子交换作用。分配层析是利用不同的物质在两个互不相溶的溶剂中的分配系数不同而得到分离的。通常用 表示分配系数。=LSC溶 质 在 流 动 相 的 浓 度溶 质 在 固 定 相 的 浓 度一个物质在某溶剂系统中的分配系数，在一定的温度下是一个常数。纸层析是以滤纸作为惰性支持物的分配层析，滤纸纤维上的 OH 基具有亲水性，因此能吸附一层水作为固定相，而通常把有机溶剂作
15、为流动相。有机溶剂自上而下流动，称为下行层析；自下而上流动，称为上行层析。流动相流经支持物时与固定相之间连续抽提，使物质在两相之间不断分配而得到分离。显然两个物质的分配系数差得越大，则越易分开。纸层析的实际操作是在滤纸的一端（通常距纸边缘 2 厘米） ，点上样品，干后，在密闭的容器内，待纸饱和了适当的溶剂蒸气后，令溶剂从有样品的一端经过毛细管的作用，流向另一端，使样品中的混合物得到分离。这种操作常称单向层析。为了得到更好的分离，还可以作双向操作或称双向层析。即在滤纸的一角上点样品，先用一种溶系统展层后，使滤纸干燥，将纸调转 90，再用另一个溶剂系统展层物质分离后，层析点在图谱上的位置，即在纸上
16、的移动速率，用 Rf 表示。Rf= 原 点 到 溶 剂 前 沿 的 距 离 离原 点 到 层 析 点 中 心 的 距每一物质的 Rf 值决定于该物质在两相间的分配系数（ ）和两相的体积比（A S/AL） 。这两种相即是水（固定相）和有机溶剂（流动相） 。 两相体积比在同一实验情况下是不变的，所以 R f 值的主要决定因素是分配系数（） 。对于某一物质在一条件下的 值是固定的。因此 R f 值为其特征常数。现将影响 R f 值的因素概括如下：1、物质结构的影响：极性物质是易溶于极性溶剂（水）中，非极性物质是易溶于非极性溶剂（有机溶剂）中，所以物质的极性大小决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况。例如酸性和碱性氨基酸极性大于中性氨基酸，所以前者在水（固定相）中分配较多，因此 R f 低于后者。CH2基是疏水性基团，如果分
