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1、阐述荧光 PCR 原理、常用探针的优缺点及多重荧光 PCR 技术进展摘要：荧光 PCR 技术是 20 世纪 90 年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测、快速、灵敏、精确等特点, 是对原有 PCR 技术的革新, 扩大了 PCR 的应用范围。本文综述了荧光 PCR 技术的原理、常用探针的原理和优缺点，PCR 技术的研究方向及其应用。关键词：荧光 PCR;探针; 多重荧光 PCR;应用聚合酶链式反应 PCR 是一种体外扩增 DNA 片断的技术，根据扩增策略和检测产物手段的不同，可分为定性 PCR 和定量 PCR。实时 PCR( rea-l time quantitative p
2、olymerase chain react ion, RQ-PCR) 又称荧光定量 PCR, 是由美国 Applied Bisystems 公司于 1996 年研制出的一种新型核酸定量技术, 并随着荧光 PCR 仪的推出而逐渐得到广泛应用 1。该技术在常规PCR 基础上运用荧光共振能量转移现象( fluorescence resonance energy transfer, FRET) 技术, 加入荧光标记探针, 巧妙地把核酸扩增、杂交、光谱分析和实时检测技术结合在一起, 在PCR 指数扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱来即时测定特异性产物的量, 并据此推断目的基因的初始量 2 。1.荧光 P
3、CR 的原理荧光 PCR 技术是指在普通 PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累监测整个PCR 反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。荧光 PCR 技术是在常规PCR 基础上，添加了一条标记了两个荧光基团的探针。一个标记在探针的 5端，称为荧光报告基团(R);另一个标记在探针的 3端，称为荧光抑制基团(Q)。两者可构成能量传递结构，即 5端荧光基团所发出的荧光可被 3端的荧光抑制基团吸收或抑制。当二者距离较远时，抑制作用消失，报告基团荧光信号增强 3。荧光信号与 PCR 产物同比增长，随 PCR产物的增加而增强。荧光 PCR 方法就是利用此原理，在 PCR 反应过程中
4、，连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一闽值(PCR 反应的前几个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光闭值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号标准偏差的 10 倍)时，此时的循环次数(Ct 值)就被记录下来，如图 1-1 所示。该循环参数(Ct 值)和 PCR 反应体系中起始模板量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性梯度标准品的 Ct 值，制成标准曲线，图 1-2 所示，再根据样品的 Ct 值就可以准确确定起始模板的数量。 2. 探针的介绍2.1 分子信标探针Tyagi 和枪 ammer(1996)首次建立了分子信标探针 4，在同一寡核苷酸探针的 5端标记荧光素、3 端
5、标记淬灭剂(DABCYL)、 、其工作原理如图 1-3 所示。分子信标探针能形成发夹结构，探针的朴琳环与目的 DNA 碱基互补，朴琳环两侧为与目的 DNA 无关的碱基互补的臂。无目的 DNA 时，探针形成发夹结构，荧光素靠近淬灭剂，荧光素接受的能量通过共振能量转移至淬灭剂，DABCYL 吸收能量后以热量形式散失，结果不产生荧光。当探针遇到目的 DNA 分子时，形成一个比两臂杂交更长也更稳定的杂交，探针自发进行构型变化，使两臂分开，荧光素和淬灭剂随之分开，此时在紫外照射下，荧光素产生荧光。影响分子信标探针构型变化的参数主要有:臂长、臂序列 GC 含量、朴琳环长度和溶液盐浓度，尤其是二价阳离子如
6、Mg2+对两臂形成的环有较强的稳定作用，在 M 存在条件下，4-12 个核苷酸可形成稳定的杂交茎。朴琳环长度至少应是臂长的 2 倍，才能保证探针与目标 DNA 杂交及荧光素与淬灭剂分离。分子信标为荧光淬灭探针，空间上呈发夹状，其环状部分与靶序列互补，位于茎干部分的 5和 3 端分别标记一个荧光分子和淬灭分子。在 PCR 反应中分子信标与靶序列杂交，发夹结构打开而发出荧光。分子信标的特殊发夹结构使之具有高度的杂交特异性，能检测单碱基突变。在 PCR 产物测定、遗传分型、药物筛选、突变分析、RNA 测定 5等领域正得到迅速应用。2.2 TaqMan 探针TaqMan 探针(亦称水解探针)是一段 5
7、端标记报告荧光基团(用 R 表示)，3端标记淬灭荧光基团(用 Q 表示)的寡核营酸。报告荧光基团如 FAM 共价结合到寡核苷酸的 5端 6。TET、vlc、JoE 及 HEx 也常用作报告荧光基团。所有这些报告荧光基团通常都由位于 3端的淬灭荧光基团 TAMRA 所淬灭。TaqMan 探针的工作原理如图 1-4 所示，当 PCR 反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 R 基团所发出的荧光信号被 Q 基团所吸收，仪器检测不到荧光信号:当 PCR 反应进行到延伸阶段时，Taq 酶在引物的引导下，以四种脱氧核昔酸为底物，根据碱基配对原则，沿着模板链合成新链，当链的延
8、伸进行到探针结合部位时，受到探针的阻碍而无法继续，此时 Taq 酶发挥它的 5-3外切核酸酶的功能，将探针切成单核昔酸，消除阻碍，与此同时标记在探针上的 R 基团游离出来，R 所发出的荧光再不为 Q 所吸收而被检测仪所接收;在 Taq 酶的作用下继续延伸合成完整的新链，R 和 Q 均游离于溶液中，仪器可继续检测到 R 所发出的荧光信号。如上所述，PCR 进行一个循环，合成了 N 条新链的同时，就水解了 N 条探针，亦释放了相应数量的荧光基团。仪器所接收到荧光信号的强度与 PCR 产物的量呈对应关系。随着 PCR 反应的循环往复，PCR 产物呈指数形式增长，荧光信号也相应增长。如果以每一个 PC
9、R 循环结束时所测到的荧光值为纵坐标，以 PCR 循环数为横坐标作图，即可得到一条如图 1-1 所示的扩增曲线。该探针出现最早，属典型的荧光共振能量转移探针。PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的 TaqMan 探针，探针的两端分别标记能量供体和能量受体，在 PCR 扩增过程中依赖 DNA 聚合酶的 5-3外切酶活性将探针酶切降解，使能量供体和能量受体分开，从而不能发生荧光共振能量转移。这一系统的不足在于线性探针的长度限制了能量转移效率，同时线性探针不能区别单碱基突变 6 。该探针的优点：杂交效率高；缺点：(1)淬灭难以彻底，本底较高；(2)探针的水解依赖于 Taq 的酶外切活性，
10、故定量时受酶性能和试剂质量影响；(3)检测点突变的能力相对不足。2.3 相邻探针相邻探针也称双杂交探针，是在普通 PCR 基础上增加了一对荧光单标记的探针，两条探针均与引物结合区之间的核酸发生特异性结合，且结合后的两条探针之间只相隔 1 一 2个碱基 7 ，其工作原理如图 1-5 所示。结合于靶序列 5端的探针在其自身的 3端标记了一种荧光素 a:结合于靶序列 3端的探针在其自身的 5端标记了另一种荧光素 b。当两条探针呈游离状态时，b 不发光;而在 PCR 的退火阶段，两条探针均与模板相结合，a 和 b 之间发生了称之为 FRET 的能量转移，a 所发出的荧光信号可以被 b 所吸收而发出荧光
11、，此时仪器便可以检测到 b 所发出的光;随着引物介导的新链的形成，两条探针被逐一从模板上取代下来; 当两条探针由模板上被取代下来重新成为游离状态，仪器就不能检测到 b 所发出的光了。荧光素 b 所发出的光强度与模板量成正比，随着 PCR 的进行，模板量呈指数增长，探针与模板结合的量同比增长，能量转移也同比增长。检测每一个 PCR 循环退火阶段荧光素 b 的荧光强度，以所检测到的荧光量为纵坐标，以 PCR 循环数为横坐标，便可得到如图1-1 所示的扩增曲线，从而实现了定性、定量检测 8 。该探针同样使用单链探针，不能检测单碱基突变基因。双杂交探针优点：特异性强，必须两个探针同时结合；本底低。缺点
12、：由于两个探针结合于模板上，因此对扩增效率产生一定的影响；需要设计两个较长的探针，增加探针设计的工作量；对仪器、耗材要求高。3. 多重荧光 PCR 技术多重 PCR 技术是在同一个反应体系中同时扩增两对或两对以上的目标基因序列 9。资料表明，多重 PcR 技术在动物病毒性传染病检测中应用较多，而在转基因成分定性与定量检测中的应用报道还不多 10，其中主要集中在转因食品方面，在转基因饲料，尤其是深加工产品的检测方面更是鲜有报道。荧光双链探针是根据核酸碱基互补配对原则和荧光能量转移原理设计的。是由两条不等长的互补的寡核昔酸链组成，在长链的 5端标记一个荧光基团，其互补链的 3端标记淬灭基团。当两条
13、链互补配对时，荧光基团靠近淬灭基团，发生荧光淬灭现象，检测不到荧光信号; 当双链发生热变性或与靶序列杂交时，荧光基团与淬灭基团分开，荧光得以恢复。由于多重荧光 PCR 技术的诸多优点，用该技术除了在我们的研究中应用于转基因生物检测外，还有着广泛的应用前景和领域 11 。如在食品卫生的应用 食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一，快速检测食品中病原细菌是及时有效预防病原细菌传播及食物中毒的重要前提，多重荧光 PCR 技术可同时检测多种病原细菌。在医疗卫生的应用沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌，严重的危
14、害着人类健康和牲畜的安全，常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高，灵敏度低，或假阳性率高，特异性差等缺点 12-14 ，多重荧光 PCR 技术的快速、简便、准确、特异地检测方法是其理想的检测方法，应用前景广阔，还有在众多的基囚诊断项目，例如检测甲、乙、丙、丁、戊各型肝炎;检测沙眼衣原体，淋球菌，梅毒螺旋体，艾滋病病毒，单纯疤疹病毒等各种性病;在遗传疾病诊断中对等位基因的检测，多基因遗传病的突变检测，基因表达异常所致的遗传病检测等等。4.荧光 PCR 技术展望准确、灵敏、快速和经济的 RQ-PCR 技术己发展成为一项完全自动化的核酸定量技术 , 大大降低了假阳
15、性率, 工作效率高, 结果重现性好, 且不必使用对人体有害的染色剂。RQ-PCR 应用较多的是医学方面, 较成熟主要是在病原体检测方面。在植物学、动物学等领域的研究中, 该技术应用还较少。随着 RQ-PCR 技术与生物芯片技术、肤核酸技术、微解剖技术 15 等先进技术的整合,RQ-PCR 应用前景将越来越广阔。 1 Heid C A, Stevens J, Livak K J, et al. Real time quantitative PCR J . Genome Research, 1996, 6( 10) : 986-994. 2 张华 , 许叔祥 . 定量聚合酶链式反应的研究进展与临床
16、应用 J . 中华检验医学杂志, 2000, 23( 2) : 120- 121. 3 Pamela M. Holland. Detection of specific polymerase chain reaction product by Utilizing the 5-3exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase J .Proc . Natl . Acad . Sci. USA，1991，88:7276-7280. 4 Tyagi S，et al. Molecular beacon : probes that fluoresce upon hybridization J .Nat Biotechonl，1996:14:303-308. 5 陈忠斌，王升启，孙志贤.分子信标核酸技术研究进展.生物化
