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1、微生物实验报告酵母菌的培养及观察实验刘欣怡 201100140057生物科学基地班组别：周一下午三组同组者：曹平平，周楠，刘艺，刘希伟实验完成时间：2012 年 11 月 19号一、实验目的1、了解酵母菌的形态及出芽方式2、学习区分酵母菌的死细胞和活细胞3、掌握酵母菌子囊孢子的观察方法4、巩固显微镜操作技术和无菌操作技术二、实验器材1菌种 ： 酿酒酵母 7d 麦氏培琼脂（产孢培养基）斜面培养物，酿酒酵母 2d YPD（酵母合成培养基）液体培养物。2. 培养基 ：酵母合成培养基，麦氏琼脂斜面3、试剂：0.01%美蓝水溶液， 5%孔雀绿水溶液，0.5%番红水溶液，95%乙醇，蒸馏水、香柏油、去离子
2、水等。4. 仪器试管，锥形瓶，酒精灯，显微镜，擦镜纸，酒精灯，载玻片，盖玻片，双层瓶，接种环，滴管，滤纸，镊子、培养皿等。三、实验原理1、培养基：酵母菌的能源主要是糖，一般用麦芽汁琼脂培养基培养。但实验要求不是很严格时，可以用由酵母膏、蛋白胨、葡萄糖配置的培养基来培养；但酵母菌子囊孢子的观察要用麦氏培养基，其有利于子囊孢子的形成。2、酵母菌：酵母菌是多形的、不运动的单细胞真核微生物，细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。繁殖方式也较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。3、酵
3、母菌的形态、大小、结构：酵母菌是单细胞真菌，并非系统演化分类的单元；酵母菌细胞的形态通常为圆形、卵圆形或椭圆形。也有特殊形态，如柠檬形、三角形、藕节状、腊肠形，假菌丝等 ；比细菌的单细胞个体要大得多，一般为 1-5 微米5-20 微米；酵母菌无鞭毛，不能游动；酵母菌具有典型的真核细胞结构，有细胞壁、细胞膜、细胞核、细胞质、液泡、线粒体等，有的还具有微体。 4、美蓝染色液：美蓝为无毒性染料，其氧化型为蓝色，而还原型为无色。用它对酵母菌染色时，由于活细胞的新陈代谢作用，使细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以酵母的活细胞无色；对于死细胞或代谢缓慢的老细胞，则因它们无
4、此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，用美蓝水浸片不仅可观察酵母的形态，还可以区分死、活细胞。美蓝（氧化型） 美蓝（还原型）蓝色 无色5、水-碘液染色液：该染液将革兰氏染液用碘液用水稀释 4 倍后得到的，亦可用于酵母形态和出芽生殖的观察。6、子囊孢子的观察：酵母菌形成子囊孢子需要一定的条件。麦氏培养基 有利于酿酒酵母子囊孢子的形成，能否形成子囊孢子及其形态是酵母菌分类鉴定的重要依据之一。孢子染色原理：孢子壁厚不易着色，但是一旦着色就很难被脱色。因此先用强染色剂（孔雀绿）下染色，使染料进入菌体和孢子，水洗时菌体中染色被洗脱而孢子中染料保留。在用对比度大的复染色剂染色后，菌体染
5、上复染色剂的颜色而孢子保留原来颜色，这样可将两者区别开来。酵母菌子囊孢子的形成过程为：还原剂（活细胞的新陈代谢）氧化剂（死细胞无还原能力）两营养细胞各伸出一个小突起而相接触，使两个细胞结合起来，而后接触处的细胞溶解，经质配和核配后，形成双倍体核，原来的细胞形成合子。此双倍体细胞可以进行芽殖。在适宜条件下，合子减数分裂，双倍体核分裂成 4-8 个单倍体核，核外再围以原生质逐渐形成子囊孢子，子囊孢子包含在由母细胞壁演变而来的子囊(即原来的二倍体细胞)中。子囊孢子的形成与否及其数量和形状，是鉴定酵母菌的依据之一。将酿酒酵母从营养丰富的培养基上移植到含有醋酸钠和葡萄糖(或棉籽糖)的产孢培养基上，于适温
6、下培养，即可诱导其子囊孢子的形成。本实验即以酿酒酵母为材料观察酵母菌的子囊孢子。7、 酵母菌是少数能在缺氧环境里生存较长时间的一种微生物，它属于兼性菌类。在一般情况下进行有氧呼吸。如环境中有丰富的糖类，它进行缺氧呼吸。其过程如下：（1）C6H12O6+6O26CO2+6H2O+2.87103 兆焦（有氧呼吸） （ 2 ）.C6H12O62CO2+2C2H5OH+109103 兆 焦 （ 缺 氧 呼 吸 ）四、实验内容用酵母合成培养基（液体状）培养酵母菌后，进行制片并用美兰染色，进行酵母菌出芽及细胞死活的观察；用麦氏培养基（固体斜面）培养酵母菌一周后，涂片制片，然后依次用孔雀绿、番红水进行染色并
7、水洗，用油镜进行镜检，观察子囊孢子。五、实验步骤1、两种培养基的配置分别配置 100ml 麦氏培养基和 120ml 酵母合成培养基，其成分配比详见附录。其中，麦氏培养基在将称量好的成分都加入后，放在加热器上加热至琼脂完全溶解，稍稍冷却，用漏斗胶管装置分别向十只试管中加入麦氏培养基各不超过 10ml，加塞并用牛皮纸包扎好；对于 120ml 的酵母合成培养基，用两个300ml 锥形瓶各盛 60ml，称量好各自的成分后，分别加入两个瓶中，轻轻摇晃匀，加塞并用牛皮纸包扎好。2、灭菌将需要灭菌的培养基（装在锥形瓶或试管中）和培养皿放入高压灭菌锅中进行灭菌。灭菌结束后，取出。3、制备斜面培养基将灭菌的试管
8、的牛皮纸解开，将十只试管分开来，均垫在一个试管上，静置冷却凝固，便形成了斜面。4、准备无菌操作台打开无菌操作台的电源开关，开始通入无菌风，打开紫外线灯照射 20 分钟，期间，玻璃门紧闭。操作开始前，关闭紫外线灯。5、接种酵母菌在无菌操作台上，酒精灯旁无菌操作用灼烧好的接种环稍稍冷却，在酵母菌培养液中轻轻蘸几下，然后分别在十支斜面划线接种，6、培养将接种的十只试管重新用牛皮纸包扎好，放置于 27下培养 7d。将灭菌的两个各装有 60ml 酵母合成培养基的锥形瓶放置在摇床上。7、美蓝浸片法观察死、活菌体及出芽A。取液：先用滴管取一滴美兰染液滴在载玻片中央，再无菌操作从液体的酵母合成培养基中取菌。B
9、。盖片：用镊子取一块盖玻片，将其一端与菌液接触并倾斜相切，缓慢将盖玻片继续倾斜并覆盖在菌液上，避免有气泡产生。C。镜检：制片成功后，即可放置在显微镜上观察，先低倍镜后高倍镜观察，但是 40 倍镜最适宜，观察酵母菌形态和出芽情况，而且根据细胞颜色区分死活细胞并大致判断死细胞和活细胞的比率；然后将制片放置 5min，再进行观察，大致判断此时死细胞和活细胞的比率。D。长时间放置观察：载玻片放置 30min 后再次进行观察，注意此时死活细胞比例的变化。8、子囊孢子染色观察A。制片：在干净的载玻片中央滴一滴蒸馏水，取在 28培养 7d 斜面培养物，涂片，并干燥固定（可以稍稍加热固定，但是以温度不烫手背为
10、原则） 。B。染色：在载玻片片上的有菌处滴加数滴 5%孔雀绿水溶液覆盖有菌部位。开始计算时间约 1.5min-2min。C。水洗：孔雀绿染色时间到后，用缓水流冲洗载玻片背面至流出的水无色。D。脱色：用 95%乙醇水溶液覆盖有菌处约 30s。E。水洗：用缓水流冲洗载玻片背面。F。复染：用 0.5%番红水溶液覆盖有菌区 1min。G。水洗并干燥： 用缓水流冲洗载玻片背面至流出的水无色，干燥载玻片。 E。镜检：制片干燥后放置在显微镜上进行观察，先是低倍镜然后是高倍镜，最后涂上香柏油换为油镜进行观察，分辨菌体、子囊及子囊孢子。六、实验结果及现象1、美兰浸片实验记录结果表 I、酵母菌出芽及活死菌观察实验
11、结果时间 活菌颜色 死菌颜色 衰亡期菌 体 死菌数量 芽体形态即刻 很少，约 1%以下5min 稍多，约占 10%30min透明无色 深蓝色 浅蓝色很多，约占60%与母体相似呈椭圆状，附着在母体上，比母体小，多数母体上有一个或两个芽体如图，酵母菌出芽生殖。2、子囊孢子观察实验结果子囊孢子呈椭圆形，边缘光滑，一般有 24 在一块。呈红色的是还未释放子囊孢子的子囊，个体较大，颜色较淡的是孢子释放以后的留下的残片。理论上，观察视野中，子囊孢子应呈现绿色，菌体和子囊呈现弱红色，但是实际的制片上观察到的都呈红色，染色不成功，原因分析在结果分析中。3、资料图片 酵母菌的子囊孢子七、实验结果及现象分析1、菌
12、落及菌体观察：固体培养基上菌落呈，白色，表面粘状；液体培养基中菌体聚集沉积在底部，为白色较浓液态。2、美兰浸片观察酵母菌的死活美兰的氧化型呈蓝色，还原型无色。由于新陈代谢，活细胞内有较强还原能力，使美兰由蓝色氧化型转变为无色的还原型，染色后活细胞呈无色。死细胞或代谢能力微弱的衰老的细胞内还原能力弱，染色后细胞呈蓝色或淡蓝色。在美兰浸片的观察中， 制片后即刻进行观察，视野中几乎没有死细胞；放置 5min 后再进行观察，视野中蓝色细胞约占 10%，即死细胞约占 10%；而30min 后再进行观察，视野中大部分细胞都是蓝色，死细胞约占 60%。从中可以看出，随着时间推移，酵母菌的死细胞越来越多，即死
13、亡率（死亡率=死细胞总数死活细胞总数100%）越来越高。3、观察酵母菌出芽经过仔细观察酵母菌的美兰装片，发现酵母菌在出芽繁殖时会在母体上长出一个芽，芽体与母体相连，但从个体大小上讲一般比母体要小一些。酵母菌的芽殖过程开始于母细胞的细胞质和壁向外突出，进而细胞核以有丝分裂方式分成两个子核，一个子核留在母细胞内，另一个子核转移到突出部分，然后细胞在突出部分缢缩而生出芽体。芽体与母细胞暂时相连，并可以重复上述过程形成一个许多芽体彼此相连的群体。当芽体长到与母细胞大小相近时，从母体上脱落下来，成为完整的新个体。4、子囊孢子的观察酵母菌是以形成子囊和子囊孢子的方式进行有性繁殖的。两个临近的酵母细胞各自伸
14、出一根管状的原生质突起，随即相互接触、融合，并形成一个通道，两个细胞核在此通道内结合，形成双倍体细胞核，然后进行减数分裂，形成 4个或 8 个细胞核。每一子核与其周围的原生质形成孢子，即为子囊孢子，形成子囊孢子的细胞称为子囊。理论上，应是观察到双数子囊孢子，一般多为 4 个，实际观察时，1、2、3、4 个都能观察到，因为子囊孢子堆叠形式不同，可能有被压在下面看不到的。理论上，经染色后子囊孢子呈绿色、菌体和子囊呈弱红色。但是，实际操作中，自己制作的片子中子囊孢子、菌体和子囊都是红色，染色不成功，分析原因如下：孔雀绿染色时间太短以及孔雀绿染色期间没有加热使得孔雀绿染色不成功；使用酒精进行脱色时，脱
15、色时间过长使得染上的孔雀绿都被脱掉了。所以，用番红水复燃时，便都被染上了红色。八、实验注意事项1、使用无菌操作台必须先进行准备工作，即通无菌风和紫外线杀菌。2、开始操作前，一定要关上紫外线灯。3、本实验中的酵母菌合成培养基是液体的，放在锥形瓶中，要用六层的纱布封口，不可以用棉塞，因为棉塞通气不好而六层纱布通气量最大。4、接种前，要将酵母菌培养液摇匀，因为酵母菌都沉在瓶底，摇匀再取菌更好。5、滴加染液量要适中，否则用盖玻片覆盖时，染液过多会溢出，过少会产生大量气泡。6、观察酵母菌时，视野里杂质较多，有淀粉粒、半分解的淀粉团块、曲霉孢子和其它杂菌等等，只要掌握住酵母菌的形状和体内具有液泡，尤其是染
16、色后体内具有褐色的核和蓝色的淀粉粒这些特点，就可以跟其它杂菌区分开来。7、发酵在缺氧的环境里仍能良好地进行，不必为了增加氧气去搅拌已放入菌种的培养液。8、用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上，盖玻片不宜平着放下，避免气泡产生。9、在染色观察酵母菌的子囊孢子的时候，应该要注意涂片时不宜涂得太厚，染色时间的控制等因素，以避免实验的结果效果不好。10、锥形瓶中装入的液体培养基应不超过 30%，避免加液量过多导致菌液内部缺氧。11、培养时锥形瓶顶部不能用棉塞密封，应用纱布以保证更好的通透性。12、从培养 2d 的液体培养基中取菌液前应先摇动锥形瓶，因为长时间培养后菌体会沉积到锥形瓶底部。13、用接种环将菌体与染液混合时不要剧烈涂抹，以免破坏细胞14、如果在观察活菌和死菌的实验中，发现视野
