色谱柱的安装,设置,老化和维护

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1、色谱柱的安装,设置,老化和维护液相色谱柱的使用方法：1、 色谱柱的使用说明：（ 1） 、色谱柱使用前注意事项：色谱柱的储存液无特殊说明，均为评价报告所示的流动相。在使用前，一定要注意色谱柱的储存液与要分析样品的流动相是否互溶。在反相色谱中，如用高浓度的盐或缓冲液作洗脱剂，应先用 10左右的低浓度的有机相洗脱剂过渡一下，否则缓冲液中的盐在高浓度的有机相中很容易析出，堵塞色谱柱。 （2） 、流动相：流动相中所使用的各种有机溶剂要尽可能使用色谱纯，配流动相的水最好是超纯水或全玻璃器皿的双蒸水。如果将所配得流动相再经过 0.45m 的滤膜过滤一次则更好，尤其是含盐的流动相。另外，装流动相的容器和色谱系

2、统中的在线过滤器等装置应该定期清洗或更换。以常规硅胶为基质的键合相填料通常的 PH 值适用范围是 2.0-8.0，BDS C18 适合于碱性化合物，PH 值适用范围为 2.0-10.0。当必须要在 PH 值适用范围的边界条件下使用色谱柱时，每次使用结束后立即用适合于色谱柱储存并与所使用的流动相互溶的溶剂清洗，并完全置换掉原来所使用的流动相。 （3） 、样品：样品也要尽可能清洁，可选用样品过滤器或样品预处理柱（SPE）对样品进行预处理；若样品不便处理，要使用保护柱。在用正相色谱法分析样品时，所有的溶剂和样品应严格脱水。2、 色谱柱的保存（1） 、反相色谱柱每天实验后的保养：使用缓冲液或含盐的流动

3、相，实验完成后应用 10%的甲醇/水冲洗 30 分钟，洗掉色谱柱中的盐，再用甲醇冲洗 30 分钟。注意：不能用纯水冲洗柱子，应该在水中加入 10%的甲醇，防止将填料冲塌陷。 （2） 、长期保存色谱柱：如色谱柱要长时间保存，必须存于合适的溶剂下。对于反相柱可以储存于纯甲醇或乙腈中，正相柱可以储存于严格脱水后的纯正己烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温。3、 色谱柱的再生因为色谱柱是消耗品，随着使用时间或进样次数的增加，会出现色谱峰高降低，峰宽加大或出现肩峰的现象，一般来说可能是柱效下降。 （1） 、反相柱的再生：依次采

4、用 20-30 倍的色谱柱体积的甲醇：水 =10：90 （V/V ） ，乙腈，异丙醇作为流动相冲洗色谱柱，完成后再以相反顺序冲洗色谱柱。 （2） 、正相柱的再生：依次以 20-30 倍色谱柱的体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。要注意上述溶剂必须严格脱水。4、 色谱柱在使用过程中易出现的问题和解决办法色谱柱在使用中最常见的问题就是柱压升高，如果柱压是在长时间使用过程中缓慢增加，属于正常现象。但柱压在使用过程中突然升高（系统管路堵塞及压力传感器故障除外） ，可能的原因有如下几点：（1） 、色谱柱头的过滤筛板堵塞或污染；（2） 、色谱柱头的填料被

5、样品污染；（3） 、色谱柱内缓冲液中的盐遇到高浓度的甲醇或其他有机溶剂，形成结晶析出；（4） 、流动相 PH 值过大或过小使固定相结构破坏或溶解。解决办法如下：（1） 、如确定是色谱柱头的过滤筛板被污染，可以将色谱柱反方向用甲醇冲洗至正常压力，或者卸下色谱柱头，将其放在 10的稀硝酸内超声清洗 10 分钟，后再用纯水超声 10 分钟，重新装入色谱柱。 （2） 、如确定色谱柱头的填料被污染，将柱头螺丝卸下，挖出柱内前段被污染的填料，用相同的柱填料重新填入，仔细修复后，重新安装上柱头螺丝。 （3） 、如确定定是盐结晶，用 10%的甲醇/水冲洗色谱柱使柱内盐全部溶解，再换高浓度甲醇。 （4） 、如果

6、因 PH 值使用不当，很难恢复。液相柱：卡套柱的安装（不加预柱） 1将卡套架套入柱芯 2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使柱芯高于夹套（见左图） 3将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片 4将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 5然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 6连接到液相色谱仪，PEEK 接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 注意：使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清 洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。 卡套柱的安装（加预柱） 1将卡套架套入柱芯 2将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见左图） 3将已套到柱芯上的卡套架

7、向上推，直至高过夹套片 4将子弹头预柱放入卡套片内 5将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧 6然后依同样的顺序连接好柱子的另一端 7连接到液相色谱仪，PEEK 接头手拧即可；若为不锈钢接头应使用专用扳手 更换色谱柱滤网和玻璃棉过滤片（同时可以修补色谱柱） 注意：在取出反相柱芯的滤网和玻璃片之前，应该将色谱柱充分用水和甲醇/乙腈冲 洗，而且修补工具的头部也应该蘸取少量的甲醇/乙腈，以避免在取出滤网和玻璃棉 滤片时带出柱子内的填料。 1将修补工具中的 2 套入柱芯的顶端 2将修补工具中的 3 轻轻地旋入已套着 2 的柱芯中，并顺时针方向旋转到旋紧 3一手握柱芯，另一只手轻轻地向外拉 3，取出柱芯

8、顶端的滤网 4用一个小铲子轻轻地取出滤网下面的玻璃棉以及被污染的填料 5将新的填料用甲醇润湿，然后填入挖去的部位，压平 6照（左图）装上新的玻璃棉滤网，并用修补工具中的 4 将玻璃棉压入柱芯顶端 7柱芯顶端套上 2，然后参照（左图）将滤网放入 8压紧，然后取下 2，再用 4 将滤网的边缘压平 平衡色谱柱 反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存 或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用 1020 倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所 使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水过渡 。 硅胶柱或极性色谱柱在经过出

9、厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相 之前用乙醇或异丙醇平衡 如何平衡色谱柱？平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）色谱柱的再生 进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。 表 1建议用来冲洗的溶剂体色谱柱尺寸 柱体积 所用溶剂的体积 125-4 1.6ml 30ml250-4 3.2ml 60ml 250-10 -20ml 400ml 请根据下表选择您的再生方法：极性固定相（如 Si，NH2* ，DIOL 基色谱填料）的再生： 正庚

10、烷氯仿乙酸乙酯丙酮乙醇水*非极性固定相（如反相色谱填料 RP18，RP8，CN 等）的再生：水乙腈氯仿（或异丙醇）乙腈水0.05M 稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱注意： 在对 NH2 改性的色谱柱进行再生时，由于 NH2 可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用 0.1M 的氨水冲洗，然后再 用水冲洗至碱溶液完全流出。 *如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用 0.05M 稀硫酸冲洗非常有效。 色谱柱的维护 1使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度） 2大多数反相色谱柱的 pH 稳定范围是 27.5，尽量不超过该色谱柱的 pH 范围3

11、避免流动相组成及极性的剧烈变化 4流动相使用前必须经脱气和过滤处理 5如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中 6压力升高是需要更换预柱的信号毛细管色谱柱的安装：步骤 1：检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等。 检查气体过滤器和进样垫，保证辅助气和检测器的通气畅通，如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物，需要将进样口的衬管清洗或更换。步骤 2：将螺母和密封垫装在色谱柱上，并将色谱柱两端小心切平，切面要平滑整齐。步骤 3：将色谱柱连接于进样口上。 色谱柱在进样口中插入的深度应根据所使用的 GC 仪器不同而定，正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。

12、通常，色谱柱的入口应保持在进样口的中下部，即处于进样针穿过隔垫完全插入进样口后针尖与色谱柱入口相距 12cm ，（具体的插入程度和方法参考所使用 GC 的随机手册）。避免用力弯曲挤压毛细管柱，并小心不要让标记牌等带有锋利边缘的物品与毛细管柱接触摩擦，以防毛细管柱断裂受损。色谱柱正确插入进样口后，将连接螺母拧上，拧紧后（用手拧不动了）用扳手再多拧 1/41/2 圈，保证安装的密封程度。不紧密的安装，不仅会引起装置的泄漏，而且有可能对色谱柱造成永久损坏。步骤 4：接通载气。 当色谱柱与进样口接好后，通入载气，调节柱前压以得到合适的载气流速。将色谱柱的出口端插入装有已烷的样口瓶中，正常情况下可以看见

13、瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡就要重新检查载气装置和流量控制器等是否设置正确，并检查整个气路有无泄漏，待所有问题解决后，将色谱柱出口从瓶中取出，保证柱端口无溶剂残留，再进行下一步的安装。步骤 5：将色谱柱连接于检测器上。 色谱柱与检测器的连接安装和所需注意的事项和色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的 ECD 或 NPD 等，那么在老化色谱柱时，应该将色谱柱与检测器断开，这样检测器可避免被污染。步骤 6：确定载气流量，再对色谱柱的安装进行检查。 注意：如果不通入载气就对色谱柱进行加热，会快速且永久性的损坏色谱柱。步骤 7：色谱柱的老化。 色谱柱安装和系统检漏工作完成后，就可以对

14、色谱柱进行老化，对色谱柱加热至一恒定温度，通常取其温度上限。特殊情况下，可加热至高于最高使用温度 1020左右，但是一定不能超过色谱柱的温度上限否则极易损坏色谱柱。当达到老化温度后，记录并观察基线，初始阶段基线应持续上升，在达到老化温度后 510min 开始下降，并且会持续分钟，当达到一个固定的值后就会稳定下来。如果在小时后基线仍无法稳定，或者在 1520 分钟后仍无明显的下降趋势，那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况，应立即将柱温降到 40以下，尽快地检查系统并解决相关的问题，如果还是继续老化，不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。一般来说，涂有极性固定相和较厚涂层的色

15、谱柱老化时间较长，而弱极性固定和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而 PLOT 色谱柱的老化方法有各不相同，须按色谱柱供应商提供的老化条件进行老化。PLOT 柱的老化步骤： ATPora 系列 250 8h 以上Molecular Sieve（分子筛） 350 12hAlumina（氧化铝） 200 8h 以上由于水在氧化铝和分子筛 PLOT 柱中的不可逆吸附，使得这两种色谱柱容易发生保留行为漂移，当柱子分离过含有高水份样品后，需要将色谱柱重新老化，以除去固定相中吸附的水分。步骤 8：设置确认载气流速。 对于毛细管色谱柱使用载气首选高纯度氮气或氢气，载气的纯度最好大于 99.95%，而其中的含氧量

16、越小越好。如果您使用的是毛细管色谱柱，那么依照载气的平均线速度（cm/s），而不是利用载气流量（ml/min）来对载气做出评价，因为柱效的计算采用的是载气平均线速度。推荐平均线速度值：氮气：1020cm/s 氢气：2025cm/s在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命，而且很大程度地降低了背景噪音，建议最好安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用 ECD 系统时，最好能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。步骤 9：柱流失检测。 在色谱柱老化过程结束后，采用程序升温作一次空白试验（不进样），一般是以 10/min 从 50升到最高使用温度，达到最高使用温度后保持 10min，这样我们就会得到一张流失图。这些数值可以后作对比试验，并且对实验问题的解决有帮助。在空白试验的色谱图中，不应该有色谱峰出现，如果出现了色谱峰，通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下，色谱柱的性能开始下降，基线的信号值会