双酶切连接反应之全攻略

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1、【原创】双酶切连接反应之全攻略（原创）双酶切连接反应之全攻略前一阵子一直在做双酶切质粒重组，失败了 很多次，不过很快改善了 实验方法，用 2 周重组了 14 个质粒。现就自己的体会，结合战友的宝贵经验，谈一下质粒重组的一些个人经验。1、回收 PCR 产物：在进行 PCR 扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如 BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的 BUFFER，以及各酶在公用 BUFFER 里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照：http:/ 3 个小时，其实 1

2、个小时已经足够。应用大体系，如 100 微升。纯化问题：纯化 PCR 产物割胶还是柱式，我推荐柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，既然如此，酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以，PCR 产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。我用的是 TAKARA 的纯化柱试剂盒酶量的问题：以 TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在 50 l 反应液中，30温度下反应 1 小时，将 1 g 的 DNA完全分解的酶量定义为 1 个活性单位(U)。 而该酶浓度约为 15 单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解 15g 的DNA，而一般

3、从 1-4ml 菌液提出的 DNA 约为 3g，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3g，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。2、酶切、回收后的 PCR 产物与载体的连接摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段=1：10，一般取前者 0.03pmol，后者取 0.3pmol。pmol 为单位的 DNA 转换为为 g 单位的 DNA：（X pmoles长度 bp650）/ 1,000,000 （注：长度 bp650 是该双链 DNA 的分子量）所得数值即为 g,也可以直接用这个公式套.1pmol

4、 1000bp DNA=0.66g,如载体是 5380bp，则 0.03pmol 为0.035.380.66=0.106524g。测 DNA 浓度可以在专用机子上测，注意 OD 值，一般约 1.8-2.0.另外，如果嫌麻烦，也可用 MARKER 进行估测，如MARKER2000，5 微升的 MARKER 每个条带约 50ng。连接反应：TAKARA 的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在 20 l 的连接反应体系中，6 g 的DNA-Hind III 的分解物在 16下反应 30 分钟时，有 90%以上的 DNA 片段被连接所需要的酶量定义为 1 个活性单位（U）。而它的浓

5、度为 350 U/l ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，最好在冰上。时间 3 个小时足已。3、转化：a、全量（10 l）加入至 100 l JM109 感受态细胞中，冰中放置 30 分钟。 b、42加热 45 秒钟后，再在冰中放置 1 分钟。 c、加入 890 l AMP 阴性培养基，37振荡培养 60 分钟。 取 100l 铺板。也可离心后余 100l几个非常重要的问题1 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为 LIGASE 酶很容易降解.为保险起见,一般连接 3 小时,16 度.2 对含有 AMP-RESISTENCE 的质粒铺板时,注意加 AMP 时的温度,温

6、度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为 55-60 度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干3 对照的设立：为验证双酶切是否成功,可做如下对照:A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种 BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功. 做转化时,也要进行对照. 设 4 个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都正常的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的

7、双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP 阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20 微升足够,检测感受态状况.4.所有的试剂切记低温保存.一步一个脚印.不要偷懒,图省事最后却更费事.注意设立对照。经 PCR 鉴定，克隆 90%-100%的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选 4 个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。希望大家不断补充。 Ding 一下，和我的方法差不多。连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于 45 度水浴 5min，马上置于冰上冷却，再加入 buffer 和 ligase。 spri

8、ngwel wrote:用 2 周重组了 14 个质粒。这个效率非常不错！佩服！ smartkevin wrote:Ding 一下，和我的方法差不多。连接前最好将水、插入片段和载体混合好以后置于 45 度水浴 5min，马上置于冰上冷却，再加入 buffer 和 ligase。这个操作是什么原理？为什么要选择 45C？ 其实也不一定 45 度，估计 50 度也行，45 度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。分子克隆 3 的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和多载体自连的情况，45 度处理是其粘性末端打开。

9、由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。 springwel wrote:酶量的问题：以 TAKARA 的为例，其对 1 单位酶的定义如下：在 50 l 反应液中，30温度下反应 1 小时，将 1 g 的 DNA完全分解的酶量定义为 1 个活性单位(U)。 而该酶浓度约为 15 单位/微升，在除外酶降解的 因素外，该酶可分解 15g 的DNA，而一般从 1-4ml 菌液提出的 DNA 约为 3g，而 PCR 纯化后的产物（50 体系）约为 3g，所以即便全部加进去，只要纯化的 质量好，酶切完全切得动。color=red但是公司给推荐的一般都是 2。

10、0ul 体系加 1ul，其实我有的时候为了省酶，在 20ul 只加 0.5ul 酶，切的也很好。我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象 lamda DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul 体系加 1ul 可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才 10ul，按推荐量加，做两个 100ul 体系需要两管，不知道有人试过没有。 smartkevin wrote:其实也不一定 45 度，估计 50 度也行，45 度对于几个碱基结合（酶切位点）的打开绰绰有余。分子克隆 3 的经典操作，个人认为主要目的如下：插入片段和载体在之前的操作过程中有部分粘性末端已经匹配，如果直接连接可能会有多重插入和

11、多载体自连的情况，45 度处理是其粘性末端打开。由于片段与载体混合、预热后马上置于冰上，使得片段与载体最大限度匹配，从而提高连接效率。如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。 mybbff wrote:如果真的是这样我觉得对于非同源粘性末端和平末端作用不大，对于同源粘性末端可能有作用。不知道还有没有其他的解释？我倒是没有仔细看过分子克隆。刚才查了一下分子克隆 3，只说了一句“以消除重新复性而导致的末端相互聚合”（中文版 p71）。其实如果是粘性末端酶切的话都是有用的，无所谓非同源和同源末端，就算是

12、非同源末端，载体和载体，片段和片段也能聚合。对于平末端应该就没有什么作用了。 autumnsun wrote:但是公司给推荐的一般都是 2。0ul 体系加 1ul，其实我有的时候为了省酶，在 20ul 只加 0.5ul 酶，切的也很好。我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象 lamda DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul 体系加 1ul 可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才 10ul，按推荐量加，做两个 100ul 体系需要两管，不知道有人试过没有。如果 100ul 里的 DNA 太多了也不行啊，酶和 DNA 还是要匹配的 我不明白的是，我们一般的质粒载体是否象 lamda

13、 DNA 一样好切，如果是那样的话，100ul 体系加 1ul 可能也够了，会省好多钱啊，尤其是有的酶，一支才 10ul，按推荐量加，做两个 100ul 体系需要两管，不知道有人试过没有。其实除了考虑酶浓度（每微升多少个单位）以外，还应该考虑这种酶在 lamda DNA 上的酶切位点数目。比如用 HincII 和 XbaI双切 pUC118，这两个酶在 pUC118 上都只有一个酶切位点，而在 lamda DNA 上的酶切位点分别是 35 个和 1 个。根据酶活性的定义，相同单位的 HincII 和 XbaI 对 pUC118 的酶切效率是 35 比 1，所以在双酶切体系中，所用的 HincI

14、I 显然应该要少很多。 好！真实用！“回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段=1：10，一般取前者 0.3pmol，后者取 0.03pmol。”是不是应该前者 0.03，后者 0.3 啊？ 精华！投你一票！ msher wrote:好！真实用！“回收的载体片段：回收的 PCR 产物片段=1：10，一般取前者 0.3pmol，后者取 0.03pmol。”是不是应该前者 0.03，后者 0.3 啊？已经改了,谢谢!昨天 14 个测序结果出来，全部是阳性克隆。两边是载体的序列，中间是插入的目的片段。回顾自己的实验现补充几点。做转化时,也要进行对照. 设 4 个:A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反

15、应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都正常的情况下.B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.D.AMP 阴性板上用同一批感受态细胞铺板 20 微升足够,检测感受态状况.就上面的对照简要说一下我的结果。转化后第二天可见 14 个标本的平皿上长了很多克隆，约 100 个左右，我用的是直径 6cm的板子，所以仍显较多，（我是先挑半个克隆并标记好行 PCR 鉴定后再对另外的一半进行摇菌抽

16、提质粒），较难挑克隆，所以铺皿时不用离心，直接用 100 微升的铺皿就可以了，我其中一个是这样做的，长得克隆较大，很好挑选。下面简要的说一下对照的结果。A 只长出了 3 个克隆，以 100 的基数计算，约为 3%。即双酶切反应中质粒只有 3%进行了单酶切B 约有 5 个克隆，即质粒完全没被切动的约 5%C 长了很多克隆，证明操作系统没有问题。为系统控制指标。D 长了很多克隆，证明感受态没有问题。这些对照相辅相成，扬长避短。万一什么都没作出来，也好分析原因。JM108 感受态细胞的制备刚开始做实验时，是向 TAKARA 购买的，一支 30 元，定了 10 支。后来干脆自己做，感觉质量和 TAKARA 的质量不相上下，下面谈谈我制作感受态的体会。前期工作分子生物耗费