微生物实验讲稿实验一 显微镜的使用及微生物形态观察一. 实验目的1. 了解普通光学显微镜的构造,学习显微镜的使用方法和保养.(高,低倍镜的使用)2. 观察细菌,霉菌,酵母菌个体形态,学会生物图的绘制.二实验原理根据凸透镜成像原理，在物镜一倍焦躁之外二倍焦距之内形成一个倒立放大的实像，成像在目镜一倍焦距之内，形成一个正立放大的虚像，如果利用一组透镜观察物体，能提高上千倍特别是油镜的使用，油镜的放大倍数最大(100), 故镜头焦距短,直径小,但所需光照强度却最大.从标本片透过的光线是从玻片进入空 气,再进入镜头.由于玻璃和空气的介质密度不同,有些光会因折射或反射而 不能进入镜头.物象就显现不清.为了不使通过的光线有所损失,在镜头和所观察物体之间加入折射率和玻璃(n=1.52)相仿的香柏油(n=1.515). 根据D=λ/ 2N.A.= λ/ 2 n·s i n α/ 2，可以增加视野的明亮度，提高折射率，增大分辨率其中数值孔径: N.A. = n·s i n α/ 2 ，n — 玻片和物镜之间的折射率 .α— 光线最大射入角.分辨率(最大可分辨距离)=λ/ N.A. ，λ —波长 ，数值孔径是反应显微镜性能的主要参数。
三. 实验器材1. 光学显微镜2. 示范片:曲霉,青霉,酵母菌, 细菌四. 实验内容(一) 显微镜的构造和使用方法1. 构造机械部分: 镜筒(双筒,两筒间距离可调,上装有目镜)转换器(3 孔,装有物镜)载物台(中央圆孔,弹簧夹,移动器 )调节器(粗调,细调)镜臂(支撑作用)镜座(上有光源,亮度可调)光学部分:目镜(10×,16×)物镜(低倍镜 10×,高倍镜 40×,油镜 100×)聚光器(内有光圈调节)光源(光量可调)显微镜放大倍数 = 目镜放大倍数 × 物镜放大倍数物镜上的标识: 1 .25 (0.65,0.25) 100(40,10) 160 0.17 数值孔径 放大倍数 镜筒长 盖玻片厚度2. 显微镜的使用低倍镜的使用(1)双手取出显微镜置于实验台上,接上电源,打开开关,调节合适光量 .(2)转动转换器,将低倍镜移至正下方.调节两目镜镜筒间的距离 . (3)将载玻片放在载物台上夹住,移动观察对象于圆孔正中 .(4)侧视物镜,转动粗调将载物台上移,至载玻片距物镜头约 5mm 时停止.(5)双眼向目镜里观察,同时旋转粗调节器使载物台缓慢下移 ,若标本显出但不清晰,可用细调节器调至清晰.若粗调旋转太快,超过焦点没有看到标本,则必须重复(4), (5)步骤.不能在眼睛观察目镜的同时旋转粗调,以防物镜与载玻片相碰撞,造成损坏.1-5高倍镜的使用在用低倍镜找到观察目标后,若需要进一步放大观察,将其移到视野中央.用转换器将高倍镜移到镜筒下方,将光量调大一点.若标本不清晰,用细调上下转动使之清晰.(此时不再动粗调)3.显微镜的维护(1)将载物台降至最低,取下标本片.(2)将光量调至最小,关上电源.(3)用镜头纸先檫目镜,物镜,再擦显微镜其它部分.(4)将显微镜放入镜箱,还原.4 微生物形态的观察1. 用低倍镜和高倍镜观察细菌,曲霉,青霉,酵母菌,放线菌,示范片.五. 实验报告1 画出微生物形态图,并标明显微镜的放大倍数.如 10 ╳ 10实验二 微生物的染色一. 目的1. 学习微生物的染色技术,掌握微生物的单染色法和革兰氏染色法.2. 复习油镜的操作.二.实验原理作为染料必须具备两个条件：一是具有颜色；二是要与被染对象之间有亲和力。
染料的颜色是由基本身的分子结构决定的，产生颜色的叫发色基团，具有成盐性质的叫助色基团发色基团往往由硝基（-NO2）,偶氮基（-N=N-）,乙烯基等形成，而由—OH,-COOH 等酸性基团和-NH2,-NHCH3 等碱性基团形成的助色基团，它们的存在使染料物质离子化，极性增强，促进染料与组织间发生作用，产生染色效果我们把助色基团中具有酸性或碱性基团的染料分别称为酸性或碱性染料作为染料，必须有发色基团和助色基团相互配合，缺一不可如伊红有一个-COOH 助色基团，在水中电离时放出氢离子，本身带负电荷，配制成伊红染料时，与强碱 NaOH 作用生成-COONa，此时的 Na 离子反而在溶液中呈碱性，所以不能认为酸性染料在溶液中就是酸性所以酸性或者碱性染料的界定并非由染料溶液PH 值决定的，而是根据染料物质中助色基团电离后的电荷来决定，一般来说，助色基团带正电荷的染料为碱性染料，助色基团带负电荷的染料为酸性染料碱性染料 PH 一定大于7，酸性染料也不一定小于 7. 碱性染料有美兰（亚甲蓝） 、甲基紫、草酸铵结晶紫、醋酸洋红、碱性复红、中性红、孔雀绿和蕃红等，在一般的情况下，细菌易被碱性染料染色酸性染料有伊红、刚果红、孟加拉红，藻红、苯胺黑、苦味酸和酸性复红等，可与碱性物质结合成盐。
当培养基因糖类分解产酸使 pH 值下降时，氢离子浓度增加，细菌所带的正电荷增加，这时选择酸性染料，易被染色1.单染色法:微生物不但个体微小,且无色半透明.要在显微镜下观察清楚,必须染上颜色 .微生物细胞中含有大量的蛋白质等一类两性电解质:在酸性溶液中结合质子带正电; 在碱性溶液中给出质子而带负电.等电点一般在 pH=2~5.所以,在中性,碱性或弱酸性溶液中,微生物细胞通常带负电荷.碱性染料在电离时,染色部分是带正电荷的,容易与带负电荷的菌体结合使之着色.经染色后的菌体细胞与背景形成鲜明的对比,在显微镜下很容易观察.2.革兰氏染色法:革兰氏染色法将细菌分为 G+和 G- ,这由两类细菌细胞壁的结构和组成的不同而决定.用结晶紫初染后,所有的细菌都染上蓝紫色.碘作为媒染剂能与结晶紫结合形成结晶紫-碘的复合物,增强了染料与菌体的结合力.用乙醇脱色处理时,两类细菌的脱色效果是不同的.G+细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成,且壁厚,类脂含量低,用乙醇脱色时使细胞壁脱水,网状结构孔径缩小,通透性降低,使得结晶紫—碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内.虽经洗脱和复染仍然保持初染剂的蓝紫色.G-细菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄 ,类脂含量高,所以在脱色处理时,类脂被乙醇溶解,细胞壁的通透性增大,使结晶紫—碘的复合物比较容易被洗脱出来,用复染剂复染后,细胞被染上复染剂的颜色.三.实验器材1.显微镜,香柏油,接种环,酒精灯等.2.结晶紫染液,碘液,95%乙醇 ,复红染液.3.菌种:大肠杆菌,枯草芽孢杆菌 .四.实验内容(一) 单染色1.涂片 取一块载玻片,用记号笔划分出两区域并做上记号,在两区域中央各滴半滴无菌水,用接种环以无菌操作法分别取两种菌种在左右两滴水中,和匀后涂成薄膜.2.干燥 室温自然干燥或吹干.3.固定 涂面朝上,通过火焰 2~3 次.4.染色 在涂片薄膜上滴加结晶紫染液,使之覆盖 2 分钟.5.水洗 倾倒去染液,斜置载玻片,用洗瓶小水流沿玻片边缘冲洗,直至水呈无色为止.6.干燥 室温自然干燥或用吸水纸吸干.(二)革兰氏染色完成单染色的 1~6 步骤后7. 媒染 加媒染剂碘液使之覆盖 1 分钟,水洗,吸水纸吸干. 8. 脱色 滴加 95% 乙醇数滴使之覆盖 16 秒钟,立即水洗,吸干.9. 复染 用沙黄(番红)液复染 2 分钟,水洗,吸干.(二) 镜检先分别用低倍镜和高倍镜找到要观察的样品区域后,用转换器将物镜转到空挡,在样品区域滴加香柏油,再将油镜慢慢转到工作位置浸入油中.若不清晰,慢慢转动微调直至清楚.油镜用完后,用镜头纸沾取乙醇-乙醚混合液檫拭油镜头.再用干的镜头纸檫干镜头.五.实验观察两种细菌的形态和颜色,绘出油镜下细菌形态图,说明革兰氏染色的结果.六.思考题通过实验,你认为革兰氏染色成功关键是那一步 为了避免假阳性或假阴性出现,在对未知菌种做革兰氏染色鉴定时,你认为应该怎样做实验三 玻璃器皿的清洗包扎灭菌一,目的要求1 熟悉微生物实验常用的器皿的名称规格2.掌握器皿的清洗包扎方法.3.掌握干热灭菌方法和原理.二,基本原理为了保证实验顺利进行，要求把实验用器皿清洗干净，保持灭菌后的无菌状态，需要对器皿进行妥善包括。
灭菌是指杀死或者消灭一定环境中的所有微生物，灭菌方法一般为物理和化学方法，本实验主要介绍物理方法即加热灭菌包括干热和湿热干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的.细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关,在菌体受热时,当环境和细胞内含水量越大,则蛋白质凝固就越快,反之含水量越小,凝固缓慢.因此,与湿热灭菌相比,干热灭菌所需温度高(160—170℃), 时间长(1—2 小时).但干热灭菌温度不能超过 170℃,否则,包器皿的纸或棉塞就会烤焦 ,甚至引起燃烧.如果对器皿进行烘干一般 120℃半小时即可冷却到 60 度打开取出三,器材培养皿,试管,吸管,电烘箱, ,培养皿(10 套一包), 等.四,操作步骤清洗方法1，任何洗涤方法，都不应对器皿有所损伤，不能用化学药剂，不能用比玻璃硬度更大的的物品来擦拭2 一般新的玻璃器皿用 2%的盐酸浸泡数小时，用水冲洗干净难洗的和易洗不能放一起，不要接触一些强酸强碱等，一般器皿能用洗衣粉肥皂清洗包扎：包扎三根吸管，10 个培养皿，三根装有 9 毫升水的试管，1 瓶装有 50 毫升的烧瓶干热灭菌1.装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品(培养皿 ,试管,吸管等) 放入电烘箱内, 物品不要摆得太挤,以免妨碍热空气流通.同时,灭菌物品也不要与电烘箱内壁的铁板接触,以防包装纸烤焦起火.2.升温关好电烘箱门,插上电源插头,拨动开关,旋动恒温调节器至红灯亮,让温度逐渐上升.如果红灯熄灭,绿灯亮,表示箱内已停止加温,此时如果还未达到所需的 160—170℃温度,则需转动调节器使红灯再亮,如此反复调节,直至达到所需温度.3.恒温当温度升到 160—170℃时,借恒温调节器的自动控制,保持此温度 2 小时.4.降温切断电源,自然降温.5.开箱取物待电烘箱内温度降到 70℃以下后,打开箱门,取出灭菌物品.注意电烘箱内温度未降到 70℃以前,切勿自行打开箱门,以免玻璃器皿炸裂.五,实验报告五实验报告1 玻璃器皿清洗注意事项2 干热灭菌原理条件思考题(1)干热灭菌完毕后,在什么情况下才能开箱取物 为什么 (2)为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高,时间长 (3)高压蒸汽灭菌开始之前,为什么要将锅内冷空气排尽 灭菌完毕后,为什么要待压力降到 0时才能打开排气阀,开盖取物 (4)在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,怎样杜绝一切不安全的因素实验四 培养基的制备与灭菌一、目的要求1 明确培养基配制原理2 掌握培养基配制方法步骤以及湿热灭菌原理方法。
二、基本原理培养基是供微生物生长、繁殖和代谢的营养基质培养基中一般含有微生物必须的碳源、氮源、能源、无机盐及水分等正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础由于微生物种类及代谢类型的多样性．因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异但一般培养基的配制程序却大致相同．例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同培养基配制完成进行分装后需进行高压蒸汽灭菌，高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内,通过加热,使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽.待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽,然后关闭排气阀,继续加热,此时由于蒸汽不能溢出,而增加了灭菌器内的压力,从而使沸点增高,得到高于 100℃的温度.导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的.在同一温度下,湿热的杀菌效力比干热大,其原因有三:一是湿热中细菌菌体吸收水分 ,蛋白质较易凝固,因蛋白质含水量增加,所需凝固温度降低(表Ⅵ-2), 二是湿热的穿透力比干热大 ;三是湿热的蒸汽有潜热存在 ,每 1 克水在100℃时,由气态变为液态时可放出 2.26kJ(千焦) 的热量.这种潜热 ,能迅速提高被灭菌物体的温度,从而增加灭菌效力.在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时,灭。