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1、酵母原生质体融合生态学院 生物 11 20 号 李香酿酒酵母，又称面包酵母或出芽酵母。酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，广泛的用于制作面包和馒头等食品及酿酒，是发酵中最常用的生物种类。酿酒酵母的细胞为球形或者卵形，直径 510m。其繁殖的方法为出芽生殖。酵母菌种优劣直接影响发酵产品的价值，在自然界中菌种大多不具有较高的价值，因而对菌种的选育和改良显得尤为重要。原生质体融合是一项应用广泛的菌种改良技术。原生质体融合 (protoplast fusion)是将双亲株的微生物细胞分别通过酶解脱壁，使之形成原生质体，然后在高渗的条件下混合，并加入物理的或化学的或生物的助融条件，使双亲株的原生质体间
2、发生相互凝集，通过细胞质融合，核融合，进而发生基因组间的交换重组，可以在适宜的条件下再生出微生物的细胞壁来。从而获得带有双亲性状的、遗传性能稳定的融合子(fusant)的过程1。目前常用的融合方法有化学融合、生物融合、电融合以及激光诱导融合等。本实验用酿酒酵母 2.339 与酿酒酵母 2.70 作为融合双亲，进行融合，旨在计算两种菌原生质体的形成率、再生率及融合率。望能将融合后的原生质体应用于酿酒生产中以获得较高的经济效益。1 材料1.1 样品菌种：酿酒酵母(Saccharomgces cerevisiae)的两种营养缺陷型菌株( 如 met-、lys-)。1.2 培养基和试剂(1)马铃薯培养
3、基：马铃薯(去皮 ) 200g，葡萄糖 20g，水 1000 mL。配制方法下：将马铃薯去皮，切成约 2cm2 的小块，放入 1500mL 的烧杯中煮沸 30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层纱布过滤，取其滤液加糖，在补足水分 1000 Ml,自然 pH。(2)YEPD 培养基( 用于酵母原生质体融合) ：酵母粉 10g，蛋白胨 20g，葡萄 20g 蒸馏水 1000 mL， pH6.0。(3)YEPD 高渗培养基( 含 0.6 mol/L NaCl 的 YEPD)：在 YEPD 培养基中 0.6mol/L NaCl，3琼脂。(4)YNB 基本培养基：0.67% 酵母氮碱基(YNB，不
4、含氨基算，Difco)，2%葡萄糖，3琼脂，pH6.2。另一配方为：葡萄糖 10g，(NH4)2SO4 1g，K2HPO4 0.125g，(5)KHPO4 0.875g，KI 0.0001g，MgSO47H2O 0.5g，CaCl22H2O 0.1g，微量元素母液 1mL，微生素母液 1mL(母液均按常规配制)，水 1000 mL，pH5.86.0。(6)YNB 高渗基本培养基：在 YNB 基本培养基中加入 0.6 mol/L NaCl。 (7)预处理液：EDTA- 巯基乙醇液，由 0.1 mol/L EDTA 配制成 0.4%巯基乙醇。(8) 原生质融合助融剂：30PEG6000、0.1 m
5、ol/L CaCl2、 pH7.0。(9) 去壁酶液：1%蜗牛酶、0.6 mol/L NH4Cl、50 mol/L DTT(二硫苏糖醇)，过滤除菌。(10)生理盐水(0.85%NaCl)(11) 0.6 mol/L NaCl(三) 实验用具试管、三角瓶、摇床、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、接种环、移液管、酒精灯、分光光度计。2 实验方法2.1 原生质体的制备2.1.1 收集菌体从斜面上取两亲本菌株各一环酵母菌分别接种于 5 mL 含有 YEPD 液体培养基的试管中，30静置培养 24 h 后，取 0.30.5 mL 转接至装有 50mL 新鲜 YEPD 培养基的 250 mL三角瓶中，摇床
6、30培养至对数早期(14 16h)，细胞数达 107-108/mL。离心(4000r/min，10min)收集菌体。2.1.2 菌体的预处理菌体用生理盐水洗两次(离心条件同前 )，去上清液后，于离心管中加入预处理液 (其用量约为每克湿重菌体用 4mL 处理液) ，30，30min，离心 (1000 r/min)，10 min ，取沉淀物。2.1.3 酶液处理去壁于上述离心管中加入新鲜配制的酶液 510 mL (酶液用量约为 1%2%)，轻轻摇动，悬浮细胞，然后于 30摇床轻轻振荡(100r/min)培养 5060min，每隔 20min 取样于相差显微镜下观察，绘图并计数原生质体的形成率(按下
7、列公式计算 )。待 90%以上细胞都形成原生质体后，离心(2000r/min ，5min)去除酶液，并用 0.6 mol/L NaCl 洗涤两次(离心条件同上) ，用 4 mL 0.6 mol/L NaCl 将原生质体制成悬液，备用。原生质体形成率=原生质体数/(原生质体数+完整细胞数)*100% 2.2 原生质体的再生将原生质体包埋于半固体琼脂中，并倾注于再生基本培养基上，这是双层培养法，可大大提高原生质体再生率。首先在培养皿中铺一底层含琼脂 2.5的高渗 YEPD 再生培养基，放温箱中烘数小时，使其表面脱水。然后将 10 mL 预先保温在 40，含有 0.5琼脂并混合了 1mL 原生质体悬
8、液的 YEPD 高渗再生培养基倒入至底层平板中制成双层平板。亦可用涂布法，将纯化的原生质体悬液，适当稀释后，各取 0.2mL，涂于含有 2.5%琼脂的 20 mL 高渗 YEPD 再生培养基上，对照用无菌水稀释原生质体，均匀涂布于 YEPD 表面。30培养 48h，分别记录长出的菌落数，并按以下公式计算出原生质体的再生率。原生质体数原生质体再生率=（高渗 YEPD 长出的菌落数-对照 YEPD 长出的菌落数）/ 显微镜计数的原生质体数 100% 2.3 原生质体的融合2.3.1 加入助融剂将双亲原生质体悬液(510710107 个/mL) 各 3mL 混合，离心(3000r/min ，10mi
9、n)弃上清后，加入 3mL 助融剂，轻轻振荡，悬浮原生质体并置 30恒温水浴保温 20min。每隔34min 轻轻摇动一次，使助融剂与原生质体充分接触，然后立即加入 10 mL 高渗 YEPD培养基，离心(6000 r/min，10min)，弃上清液可获得融合沉淀物(即原生质体融合物)。2.3.2 稀释及涂布用 0.6 mol/L NaCl 悬浮以上获得的原生质体融合物，并进行稀释至 10-3，分别从 10-2、10-3 中取 100L，涂于 YNB 基本培养基平板上。2.3.3 选择融合子及计算融合频率将以上培养物于 30培养 35d，从长出的菌落中选出融合子。并同时在基本培养基上作单独亲本
10、株的原养型回复突变。另取等量稀释液用相同方法于再生完全培养基中培养后，并计算菌落数。以上是测定融合频率的涂布法。亦可用双层平板法，首先在培养皿铺一层含琼脂 2.5%的高渗 YEPD 再生培养基，制成底层平板，放温箱中烘数小时，使其表面脱水。然后将 10 ml 预先保温在 50 下，并混合了 0.1mL 原生质体融合物的 YNB 高渗基本培养基倒入至底层平板中，制成双层平板，同涂布法，置 30培养 35d，从长出的菌落中选出融合子。按下列公式计算融合频率：融合频率=（融合子数*稀释倍数）/（再生培养基上生长的总菌落数 *稀释倍数）*100% 3 实验结果与分析3.1 原生质体形成率用新鲜制备的去
11、壁酶液 5ml，轻轻摇动，然后于 30摇床振荡培养 50min，根据 2.1.3 原生质体的形成率计算公式，结果如表 1.1 所示。酶液处理后，原生质体形成率分别达到91.30%和 96%，,其中酿酒酵母 2.339 的原生质体形成率较高，说明酶液的水解细胞壁效果对酵母 2.339 的效果更为理想，有利于下一步原生质体融合。表一 原生质体形成率结果酿酒酵母菌株 原生质体数 完整细胞数 原生质体形成率2.70 6.30*108 6.90*108 91.30%2.339 1.92*109 2.00*109 96.00%3.2 原生质体再生率 将双亲原生质体悬液分别用 0.6mol/LNaCl 稀释
12、至 10-5，用 0.2ml 涂布于 YEPD 高渗和YEPD 培养基中。30培养 48h，分别记录长出的菌落数，并用 2.2 中公式计算出原生质体的再生率。其结果如表二所示。从表中可知，原生质体的再生率较低，可能是由于培养基的配制不规范，导致原生质体的再生不理想。表二 原生质体再生率结果酿酒酵母菌株YEPD 中的平均菌落数YEPD 高渗长出的平均菌落数显微镜计数的原生质体数原生质体再生率2.70 13 274 6.30*108 4.14%2.339 138 606 1.92*109 2.44%3.3 原生质体的融合率将处理后的原生质体融合物，稀释至 10-2、10 -3，涂布于 YNB 和
13、YEPD 高渗培养基上。3d 后计算菌数，结果如表三所示。结果显示，稀释倍数为 10-2 时，培养基上菌落连成菌苔，无法计数。10 -3 稀释倍数下，YNB 培养基上菌数生长茂密，但仍可计数。表三 原生质体融合率结果稀释倍数 YEPD 高生长菌落数 YNB 生长菌落数 融合频率10-2 无法计数 无法计数 /10-3 442 1884 23.46%4 讨论原生质体融合方法多样，基本的有化学法和物理法 2。常见的化学法有 PEG 结合Ca2+、PH 诱导法。化学方法的优点是不需要特别的仪器，操作简单，但其化学物质存在一定的毒性，融合率不高。物理方法有电融法和激光诱导融合法。电融合法的有无毒、直观
14、、融合效率高等优点。激光诱导融合法毒性小，损伤小，但由于设备复杂，操作难度大，融合率低等缺点难以大范围使用，尚处在发展阶段。本实验采用化学方法，得到的原生质体融合率为 23.46%，根据王娟娟的等人的研究，采用电融合技术，添加 PEG 助融剂可使双亲融合率达到 70%-80%，融合率极高，可见，本次试验中融合率较低，有待进一步完善。实验中，两种酵母的原生质体再生率很低，可能是由于 YEPD 及 YEPD 高渗培养基的配制不规范，导致培养基中成分改变，不符合原生质体再生的培养条件，导致原生质体再生率较低。原生质体融合技术是现阶段菌种改良的重要技术手段，但在原生质体融合过程中，如提高融合率，培养新的优良性状，保持遗产的稳定性的问题，还有待进一步的研究。参考文献1 黎永学, 张德纯, 李代昆. 双歧杆菌杆和酿酒酵母原生质体融合子筛选方法的探究J. 食品科学, 2006, 27(2):85-86.2 王娟娟, 贾彦军. 微生物原生质体融合方法的综述J. 畜牧兽医科技信息, 2005, 10:10-15.
