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1、第 24 章 鸡蛋蛋白中提取出的多肽的降压活性1 引言食品蛋白质中的酶水解作用可以释放多肽，这些多肽可以发挥不同的生物活性作用。迄今为止在所知道的这些生物活性肽中，有降压效应的那些会得到特殊的关注，这是由于在西方人口中高血压的重要性和流行性。鸡蛋被广泛的认为是对人体营养非常重要的蛋白质来源，而且大家已经知道其具有基本的营养外还包含许多生物功能物质。一个对从鸡蛋成分中提取蛋白质和多肽生物活性的评论最近发表了。本章节讨论就从鸡蛋蛋白质而言提取的降压肽产品及其效果。2 食品中多肽的抑制 ACE 和降压效果高血压是一个对心血管疾病和中风构成危险的因子，由于在过去 20 年间所进行广泛的研究，从食品蛋白
2、质中提取的肽的广泛的排列顺序已经被大家所清楚，这对预防或者治疗高血压有极潜在的用途，这些肽中的大多数至少在体外作为血管紧张肽酶（ACE，二肽水解酶，EC3.4.15.1）的抑制剂，ACE 是一种外肽酶（肽链端解酶）从各种低聚肽的 C 端来切断二肽。作为肾活素血管紧张素系的一部分，ACE 水解非活性的十肽，血管紧张肽，对有效的血管收缩剂血管紧张素来说，ACE 也是激肽-激肽释放酶系统的一部分，就如水解血管舒缓激肽一样，有一个血管扩张效应。一些 ACE 抑制剂多肽的结构活动关系的一般特征已被描述。ACE 似乎更喜欢底物或是有竞争的抑制剂，他们包括在 3 个 C 端的位置中的每一个位置的疏水（芳香族
3、的或支链）氨基酸残基，而且已经知道作为一个 C 端或是倒数第三个残基的蛋白质的存在增强了其结合力。另一方面，ACE 只是很微弱的结合到有竞争性的肽抑制剂，这种抑制剂具有倒数第二的蛋白质残基，除此之外，作为 C-端残基，赖氨酸（-氨基基团）或是精氨酸（胍基基团）的正电荷的存在，可能对抑制剂效能有帮助。为辨别独特新颖的降压食品肽最常用的方法是建立在蛋白质水解产物的制备和在体外 ACE的活性抑制剂下搜寻碎片基础上的。体内的效果在自发性高血压大鼠（SHR）上已经试验，这为解决人高血压提供了可接受的模型。一般来说，这些试验的结果已经强调了一个很重要的缺乏体外 ACE 抑制剂活性与体内反应之间的联系。这造
4、成一种疑虑，即把体外 ACE抑制剂活性作为可能的降压药物的独家选择的标准，并没有考虑生理学上的转化，然而这却决定肽的生物利用度或是除了 ACE 抑制以外的反应机制的可能性。ACE 抑制肽的生理效应依赖于他们的接触靶位点完整性的能力，这可能包括通过肠道上皮到外围器官胃肠消化和吸收的幸存量。ACE 抑制肽的释放依赖于食品蛋白质的消化，和已知 ACE 抑制剂顺序的消化的抵抗，这种释放已被一些体外研究试验，结果表明在决定ACE 制剂活性时胃肠酶作用的蛋白水解是一个很必要的因素。除此之外，生理效应受刷状缘肽酶作用，肠肽载体的识别以及随后的对血浆敏感性的影响。在这一方面需要更多的研究，努力阐明药物代谢动力
5、学和 ACE 抑制肽在不同组织中的分布范围。即使从食物中分离出的 ACE 抑制肽的低血压效应已经被 SHR 证实，只有一少部分作出来的研究可以证实在体内 ACE 抑制机制的存在。而且，大多数食物提取肽在体外比合成ACE 抑制剂甲巯丙脯酸有较低的 ACE 抑制剂活性，但是他们通常展示出比从体外活动推测出的效力水平更高的体内活性，这个事实归因于对组织更高的吸引力和更慢的消除，但可能也是一个额外作用的模式存在的指示，例如对血管平滑肌的直接或间接作用。也应该提到通过不同的酶水解食品蛋白质而使多肽具有抗氧化性。有力的实验证据指出了氧化的压力和相关联的氧化破坏是心血管致病的中介。尽管与降压药相比需要高剂量
6、，含有降压肽的食品产品的消费表现了显著的降低温和高血压患者的血压。已经得到人体最具有实体化的降压活性，为了商业发酵乳和包含 ACE抑制肽 IPP 和 VPP 的乳蛋白水解产物。这是个在日本 Calps 的商标商业化的酸牛奶的案例，这种牛奶用瑞士乳杆菌 Lb.helveticus LBK-16 发酵，一种用米曲霉 Aspergills oryzae 处理过的干酪素水解物，被 Calpis 作为胜肽 Amealpeptide 所营销，在 Flora 或 Becel 先前的牌子下由 Unilver 发起的这个运动，被添加到一种新牛奶饮料。3 从鸡蛋蛋白中获得的降压水解产物为 ACE-抑制剂和降压肽的
7、产品，很普遍采用的方法是在一种或多混合酶的作用下进行食品蛋白的制备。来自于各种原料的混合酶已被应用，包括动物消化酶，植物和微生物酶。二者择一的，有活力的肽可以在某些食品产品发酵的过程中分离出来，这些产品通过发酵微生物主要是乳酸菌的蛋白水解体系的作用下产生的。用根酶种属的粗酶得到的蛋黄的水解产物在体外显示出 ACE 抑制活动，分子质量低于 1kDa 的水解碎片，压制了 12 周内经口摄入后 SHR 高血压的发展。摄入水解产物的SHR 小组的血清 ACE 活性显著低于依赖服药方式而控制的小组。这意味着 ACE 抑制机制在体内的存在。也在卵清和粗蛋清的酶解产物中发现体外 ACE 抑制活动，然而没有水
8、解的底物并未显示出抑制特性。最大化的抑制可用 IC50 或抑制酶活性的 50%所需的浓度来表示，在胃蛋白酶（IC 50=45.3-55.3g/ml;）水解后可以看到。胃蛋白酶也展示出对卵清蛋白最高的蛋白水解活力，尽管完整蛋白的含量与随之产生的 ACE 抑制性之间没有直接关系。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理并没在水解 3 小时后产生 ACE 抑制性的水解肽。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶处理过的水解产物的 IC50 降低了潜伏的时间，随着水解作用进行，但是作为结果的ACE 抑制水平比被胃蛋白酶处理后的更低了。这表明被用于释放肽的蛋白酶的特性起着重要作用，以至于甚至一个低程度的水解作用可以提供显著的 AC
9、E 抑制性。水解产物可以作为这些或是在富集以后应用于食品产品的制造中，碎片的富集或从全肽混合物中特殊肽的分离在生产 ACE 抑制剂和降压肽是一个技术上的挑战。由于 ACE 抑制肽的一个普遍特征是他们相对小的尺寸，用超滤分离和体积排斥色谱为预浓缩提供了有用的步骤。实际上，当从经过胃蛋白酶处理过 3 小时（IC 50=55.3g/ml）的粗蛋白的水解产物经 3000Da 的截止膜过滤，渗透物显示出比滞留物（IC 50=34.5，IC 50=298.4g/ml 分别地；）大约 10 倍多的抑制活性。经胃蛋白酶的蛋清水解物及其分子量低于 3000Da 的碎片的血压降低效果已经体内实验，实验中把这些产物
10、强制胃部插管喂食 SHR。这两种都产生了对心脏收缩压和舒张压显著的药剂量依赖的降低，分别的最低有效剂量为 150mg/kg，50mg/kg. （图 1） 。SBP 和DBP 的最大值降低是在分别喂食 6 和 4 小时后，两者的变量在 24 小时后返回基线。应该提到的是在短期的试验中未水解的蛋清没有显示出任何血压降低行为。实际上，报告指出卵清蛋白只是在非常高的剂量下对发挥降压活性（2g/kg） ，有必要强调出水解产物并没改变在 WKY 鼠中的 SBP 和 DBP，这却是用于 SHR 血压正常的控制。这说明了他们的效果对高血压状态是很特殊的，正常生物可能是不产生血压效应的。水解产物的降压活动及其低
11、分子质量碎片与其他食品蛋白水解物的活动相比在体内是更顺利的，在这种背景下，要提到的是消化干鲣的嗜热菌蛋白酶在 SHR 剂量是250mg/kg，而分子质量低于 3000Da 的碎片有一个大约 2 倍的更高活性。而且，富含干酪素发酵奶降低了 SHR 的平均动脉血压，药剂量从 500 mg/kg 到 2500 mg/kg，血压从-13mmHg 到-25mmHg。图 1 不同产品喂食自发性高血压大鼠（SHR）引起心脏收缩压（SBP）的降低。水（ ） ，甲巯丙脯酸一种合成 ACE 抑制剂，50 mg/kg（ ） ，胃蛋白酶处理过的分子量低于3000Da 的蛋清水解物碎片25（ ） ，50（） ，100（
12、）mg/kg 。数据是有平均数 标准差表示的从生命中的第 3 周到第 20 周每天喂食 SHR 0.5 至 2g/kg 水解产物，来研究这种水解物一个长期的血压效应。这两种剂量都减弱了高血压的发展，而其自然地发生在 SHR 生命的早期。不仅如此，饮用非水解蛋清溶液的 SHR 的 SBP 轻微的低于饮用自来水的 SHR 的SBP，尽管低的程度不显著。因此，不能丢弃体内蛋清蛋白胃肠消化过程中产生的降压肽。把这些处理撤消后，动脉血压在摄食水解物的大鼠体内逐渐上升，尽管 SBP 保持一个持续比水控制组低的状态。4 抗高血压的鸡蛋中的多肽：生物利用度及其作用机制为了达到 ACE 抑制和降压肽的目的，建立
13、在疏水性的基础上的用 C18 墨盒反相或反相色谱法肽的富集和纯化，在实验室是经常用的。串联质谱仪在线耦合允许同时的阐明肽的顺序。氨基酸顺序分析也用于肽被连续色谱法步骤纯化的情况。按照这些策略，不同肽可以分辨出蛋清或是卵白蛋白的酶解产物。他们的 ACE 抑制活性的顺序和尺寸的化学合成提供了一些有效的体外 ACE 抑制肽（表 1） 。然而，重要的是需要对 ACE 抑制成分的体内效果进行试验，从而建立他们可能的用途。实际上， F 从卵白蛋白胃蛋白酶的消化中分离出 6种 ACE 抑制剂序列， IC50 从 0.4 变化到 15M，但是都预料二肽 LW 在 SHR 中没有显示降压活性。这得因于那些肽是
14、ACE 的底物，因此很容易被酶水解，但其并不是真正的抑制剂。就如表 1 所示，经胃蛋白酶作用的卵清蛋白的水解产物所显示出的这些肽序列中，八肽 FRADHPFL，被 F 命名为卵激肽，拥有一个很高的 ACE 抑制活性（IC 50=3.2M;）,而且在犬肠系膜的动脉中发挥了血管放松的效应。 ，当口服溶液剂量在 100 mg/kg 或是 25 mg/kg，30%鸡蛋黄乳状液的形式卵激肽显著的降低了 SHR 的 SBP。类似的，肽RADHPFL，也是由胃蛋白酶产生，与卵激肽的序列很相似，但是缺少 N 端苯丙氨酸残基，显示了一个高 ACE 抑制活性（IC 50=6.2M）和显著的降压效果，用药剂依赖的方
15、式降低了SHR 的 SBP 和 DBP，最小的有效剂量是大约 2 mg/kg。Matoba 等从经胰凝乳蛋白消化的卵清蛋白中净化出一个与卵激肽（RADHPF）的 2至 7 个碎片相当的六肽。卵激肽发挥了 SHR 肠系膜动脉药剂依赖的血管舒张效应和在口服剂量 10 mg/kg 后低血压行为。然而，应该注意到，与迄今所描述的大多数口服活性降压食品肽正相反，卵激肽（2-7）仅是一种弱地 ACE 抑制剂（IC 50 400M;） 。实际上，当强效ACE 抑制肽 FRADHPFL（卵激肽）和 RADHPFL 被像模仿肠胃消化过程一样经水解作用，主要的降解产物是 RADHPF（卵激肽 2-7）和 RADH
16、P， ACE 抑制活性相当的降低了。RADHP 看起来似乎是降压肽 FRADHPFL（卵激肽） ，RADHPFL 和 RSDHPF（卵激肽 2-7）的胃肠消化的终产物，在剂量 2 mg/kg 下喂食 SHR2 小时后，显著的降低了血压，但降压效应通过 ACE 抑制机制可能并没终止。肽 YAEERYPIL，经胃蛋白酶解的卵清蛋白的产物，是一种强 ACE 抑制剂（IC 50 =4.7M） ，在剂量大约 2 mg/kg 下也展示出对 SHR 很显著的降压效果， SBP 和 DBP 降低的最大值是在摄食 6 小时后看到得，而且这种效应会持续至少 8 个小时。要显示降压效果所需肽的数量是相对比较少的，与其他 ACE 抑制肽的有效剂量 5 mg/kg 相一致。例如，以剂量 5 mg/kg 给 SHR 喂食强有力 ACE 抑制剂 VPP 和 IPP6 小时后，SBP 分别降低 20.1mmHg和 18mmHg。YAEERYPIL 模拟胃肠消化后完全水解，其 ACE 抑制活性降低了大约 100 倍，释放出的主要部分是
