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1、一、实验目的1.了解绿色荧光蛋白和共聚焦扫描显微镜在细胞分子生物学中的应用2.学会使用质膜蛋白的分析软件。 二、带 GFP 的质膜蛋白分选概述1质膜蛋白的跨膜信号在粗面内质网上合成的蛋白质有两类：分泌蛋白和膜蛋白，分泌蛋白在内质网上合成之后通过多种信号切除后释放到内质网的腔中，进行下游途径的转运。膜蛋白较为复杂，它要靠疏水区滞留在内质网膜上。下面以酵母二价铁的转运蛋白（IRT）为例来说明膜蛋白的转运。IRT 除了含有信号肽（也称开始转移序列 start transfer sequence是引导和启动肽链穿过内质网膜的信号肽) 以外，还有八个跨膜结构域，这里有一个定向问题，即羧基端和氨基端位于内
2、质网的内侧还是外侧问题。经 TMpred 和 TMHMM 预测的 IRT 的跨膜螺旋结构域，发现它的羧基端和氨基端均位于质膜的外侧。这样推测 IRT 在粗面内质网共翻译和转运时，羧基端和氨基端均位于内质网的内侧。推测 IRT 除了开始转移序列外，还有四个内部起始转移信号（internal signal sequence ）启动多肽链的转移和四个终止转移序列 (stope transfer sequence)。终止转移序列可能有某些序列与内质网膜有很强的亲和力，紧密结合在膜脂双层中而不再转入内质网腔中。内部起始序列和终止转移序列都不被切除，整个多肽链作为穿膜八次的跨膜蛋白定位在膜中。总结如下 一
3、种多肽只有 N 端信号肽序列（或称开始转移序列）, 无停止序列 T 此蛋白合成后进入内质网腔中；多肽的内部起始序列和终止转移序列位于分子中部，而且不被切除 T 跨膜蛋白；含多个内部起始序列和多个终止转移序列 T 多次跨膜的膜蛋白。2 GFP 的特性绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP）是一种能够自身催化形成发色结构，并在蓝光或紫外光的激发下发出荧光的新型报告基因。GFP 的发现及其研究迅速发展，使人们能够在正常生活条件下对活细胞内分子水平上进行的各种过程及其分子机理进行观察和研究。目前的研究表明，GFP 能在多种生物，如细菌，酵母，植物及哺乳动物中表达且产
4、生可见荧光,因此有着很高的应用价值。GFP 之所以能产生绿色荧光是由于其蛋白分子多肽链内含有特殊的生色团结构，即第 65-67 位氨基酸 Ser-Tyr-Gly 链，它们可自身环化在氧气的参与下与周围其它三个氨基酸形成六肽生色团。晶体结构分析表明，GFP 分子为致密管状，由周围 11 个 -折叠片围绕中央一个 -螺旋构成，其生色团即包含在该中央 -螺旋结构中。GFP 蛋白非常稳定，其光谱特性一般不受变性溶液的影响。所以它用于生物技术的许多方面具备以下优点：GFP 发出荧光不需要外加任何底物或共作用因子，仅用蓝光或紫外光照射即可激发荧光，所以检测非常方便，用显微镜、荧光计、荧光激活细胞分选仪等就
5、可以实现。GFP 荧光稳定且没有物种特异性，在原核、酵母、植物以及动物细胞中都获得了成功表达。GFP 基因序列较短，可以与其它基因一起构建到载体上进行转化而不致于因为质粒过大而影响转化频率。GFP 基因的表达产物对生活细胞基本上没有毒害作用，不会影响细胞的正常生长及功能。3GFP 用作亚细胞定位标记利用 GFP 的荧光特性对某一蛋白的 N-或 C-末端进行标记，然后借助荧光显微镜或共聚焦显微镜便可对标记的蛋白进行细胞内活体观察。标记过程是利用常规的 DNA 重组技术将 GFP 基因与目的蛋白基因的编码区连接形成一个单一的融合基因表达载体，然后将这一重组表达载体导入细胞，使融合蛋白得到瞬时或稳定
6、表达，通过检测这些 GFP 的荧光来测定这些蛋白的位置。另外 GFP 也大量用于各种细胞器的标记，包括细胞骨架、细胞分泌及膜转运、质膜、细胞核、中心体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体和高尔基体等。利用这一技术，也可以测定某些细胞的分布和生长状况，尤其是一些透明的动物和植物组织内特定细胞和生长化合物分布情况。4本次实验路线将二价铁转运蛋白 Irt（一种质膜蛋白）基因的 cDNA 全长构建到酵母载体上，将 Irt基因的终止子去掉并结合绿色荧光蛋白的基因，表达载体结构见图 9-6。利用醋酸锂的方法转化酵母突变体细胞（DDY4），带有 GFP 的质膜融合蛋白 pDB-Irt-GFP 就可以根据膜蛋白的共
7、翻译转运机制，通过内膜系统的囊泡（vesicle)运输，将 Irt 定位到质膜上，而且在荧光显微镜和共聚焦显微镜上可以看到 GFP 发出的荧光。动画一动画二三、材料、试剂和仪器1材料DDY4 酵母突变株（fet3-2:HIS3/fet3-2:HIS3，fet4-1:LEU2/fet4-1:LEU2，ade2/+ura3/ura3 trp1/trp1 leu2/lue2 his3/his3 can1/can1）。重组的酵母质粒pBDLeu-IRT-GFP2 试剂与培养基试剂和转化子筛选培养基同实验 33。3器材恒温培养箱，恒温摇床，恒温水浴锅，离心机 ，三角瓶，培养皿，微量取样器，1mL枪头，5
8、0mL 大离心管，1.5mL 小离心管，封口膜，pH 试纸，牙签或接种环、小滤器、注射器、涂布器等。四、实验程序1 酵母菌落直接质粒转化法1）用牙签从平板中挑取单菌落（直径 23cm ） ，转移到 1.5mL 的无菌离心管中。2）将 10l 载体 DNA（100g）与 10l 转化质粒 DNA 混合，振荡均匀。 （若转化DNA 是用未经 RNA 酶处理的“mini-prep DNA”方法制得，则不需加载体 DNA） 。3）加 0.5mL PLATE 溶液，振荡。4）置于实验台上，室温培养 4 天。5）置 42下热激 15min。6）以 5000g 离心 10sec 沉淀细胞，小心弃去上清液，将
9、细胞轻轻悬浮到 200l 细胞悬浮均匀，再直接将混合液涂平板。2 转化酵母的荧光显微镜和共聚焦显微镜观察挑取不同平板上的阳性转化体单克隆（生长三天） ，在 YPD 液体培养基里摇菌过夜（大约 20 个 hr） ，摇起来后用微量取液器吸取少量菌液滴到载玻片上，盖上盖玻片压片，然后在荧光显微镜下观察，看到荧光后再用共聚焦显微镜观察。五、结果与分析图 5-3 是质膜蛋白质（ IRT）分选的实验结果。实验材料是芽殖酵母细胞，所用的载体为酵母质粒载体（pDB） ，发绿光的是 GFP六、 思考题1 细胞质膜蛋白是通过什么方式运往细胞质膜的？2 膜蛋白氨基端和羧基端的方向如何决定？3 图 9-7 是质膜蛋白质（IRT）分选的实验结果。如果给你一个构建好的融合蛋白的重组子（pDBLeu-IRT-GFP） 。请问你如何操作，证明它被分选到质膜上
