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1、发现生物大分子高亲和性配体的新方法SAR-by-NMR麻锦彪吴厚铭 *摘要由于许多药物通过和生物体内的大分子（如蛋白质和核酸）的选择性结合发挥效用，因此快速、有效地发现靶分子的高亲和性配体成为各种药物发现方法的首要目标。在现代生物技术和 NMR 技术高度发展的基础上产生的一种发现生物大分子高亲和性配体的新方法SAR-by-NMR，由于采用 NMR 技术可以综合多种药物设计方法的优势，能够在短时间内得到先导化合物，从而大大加快了药物发现的速度并能节省大量的费用。本文介绍了 SAR-by-NMR 发现高亲和性配体的基本原理、特点及其在药物发现中的应用。关键词高亲和性配体蛋白质 NMR 结构结构与活
2、性关系药物发现A New Method to Discover High-Affinity Ligandsfor Bio-Macromolecules：SAR-by-NMRMa JinbiaoWu Houming(Shanghai Institute of Organic Chemistry,Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China)Abstract As most drugs work when they selectively bind to biologi cal targets(e.g. proteins and nucle
3、ar acids), to find high-affinity ligands for a target molecule fast and effectually becomes the key step of various drug-di scovery methods. A new technique to discover high-affinity ligands for bio-mac romolecules, SAR-by-NMR, comes into being on the bases of high developments of modern biological
4、and NMR technologies, which significantly accelerates the drug discovery and reduces the expenses. This method combines the adv antages of many drug-design methods and requires only short time to get lead co mpounds due to the use of NMR technologies. The essential principle of usin g SAR-by -NMR to
5、 find high-affinity ligands, its distinguishing features, and applicati ons in drug discovery are reviewed in this paper.Key words high-affinity ligands; protein NMR structures; structur e-activity relationship(SAR); drug discovery一、引言新药的发现是一个极其困难并且需要投入大量时间和财力的过程。据统计，现在运用传统的研究方法每产生一个可投入市场的新药的费用高达 6
6、亿美元，耗时约 6 至 10 年 1 。要得到一个具有良好生物利用度（bio-availability）、代谢稳定性和低毒性的药物，首先是要寻找到和生物靶分子高度亲和性、选择性结合的分子，因为大多数药物都是通过和生物体内的大分子（如蛋白质）结合起作用的。为了能快速地寻找到这样的分子（通常称为先导化合物，leadcompound），近 20 年来人们发展了许多方法。这些方法基本上可以分成两大类：合理性药物设计和非合理性药物设计。合理性药物设计是以了解生物大分子（如蛋白质）的三维结构及其相关的分子识别为基础的。大量蛋白质的三维结构已由 X 射线晶体衍射技术和多维核磁共振（NMR）技术解析而得，为研
7、究蛋白质-配体复合物的分子识别提供了有利条件，而且已经有一些药物设计成功的例子2，3 。然而，小分子配体和蛋白质进行分子识别形成复合物的过程并非象钥匙和锁的模型那样简单，而是一个双重诱导契合（double-inducedfit）的过程，即小分子和蛋白质都改变自身的构象以达到相互最佳匹配的结果（图 1）。在生成复合物的过程中，占据配体和蛋白质结合位点的一些溶剂分子（通常是水）被配体替代形成溶剂化复合物。由于技术的限制，残留在配体和蛋白质之间的水分子的存在方式（如生成氢键）常常是难以预测的。合理化设计面临的另外一个问题是生成复合物的自由能变化至今还没有可靠的计算方法 4 。精确度在3kcalmol
8、-1的计算方法造成所预测的配体亲和性的误差可达 2 个数量级以上 3 。因此，虽然了解蛋白质的三维结构在一定程度上对设计药物有所裨益，但即便得到可信的初步结果(如利用 LUDI 软件包) 2 ，至今还没有一个发表的先导化合物结构是完全用从头设计(denovodesign)的方法得到的 5 。图 1蛋白质-配体双重诱导契合模型示意图近年来药学领域的一些代表人物认为合理性设计作用不大，而趋向于所谓“快速筛选”(high-throughoutscreening)的方法。由于该方法无需知道蛋白质的三维结构，而是运用组合化学技术对含有数十万乃至数十亿个分子组成的化合物库进行同步合成、筛选，从而寻找到生物
9、活性最高的化合物作为先导化合物进行结构测定和优化，因此又被称为非合理性药物设计 6 。它的缺点是由于生物检测系统有限的灵敏度，只有活性非常高的分子才能从庞大的化合物库中被检测出来。而且多种官能团的结构多样性问题以及酰胺和酯键限制药物的生物利用度的问题也需要进一步解决 7 。Abbott 实验室的 Fesik 小组在过去的一年发表的工作使药物发现的研究有了一个飞跃。他们通过 NMR 将上述合理性药物设计和非合理性药物设计（组合化学）巧妙地结合起来，产生了一种极为有效的发现药物靶分子高亲和性配体的方法，称为 SAR-by-NMR8，9 。这种新方法结合了合理性设计中的配体设计和优化方法（如 LUD
10、I）和非合理性设计(如组合化学)的合理因素，大大地提高了先导化合物发现的速度和有效性。SAR-by-NMR 的出现除了由于药物发现领域本身各种方法不断发展之外，也离不开相关领域的发展与成熟。例如分子生物学的发展，通过基因工程和蛋白质工程可以得到大量经过重组的纯的蛋白质，而且可以对蛋白质进行稳定同位素标记，使蛋白质适于做 NMR 结构分析 10 。多维核磁共振技术自身的不断成熟和发展，使其可以解析越来越大的蛋白质11 ，尤其重要的是，由于蛋白质可以在接近生理环境的溶液中进行NMR 结构测定，因此得到的配体和蛋白质相互作用结构信息更为直观、可靠。这也是 SAR-by-NMR 成功的一个关键因素。二
11、、SAR-by-NMR 的基本原理和特点用 SAR-by-NMR 的方法发现高亲和性配体一般需要 5 个基本步骤（图 2） 8 ：第 1 步，从一个小分子化合物库中筛选出一个和 15N 标记的靶蛋白结合的小分子。由于小分子和蛋白质结合后，会改变蛋白质结合位点的局部化学环境，因此通过二维 15N-HSQC 谱中 15N 或 1H 的化学位移的变化可以检测到结合作用。同时配体和蛋白质的结合常数可以通过化学位移的变化和配体浓度的关系测得。第 2 步，对第一个先导分子的类似物进行筛选，测定结合常数，通过结构与活性的关系对其进行优化。第 3 步，用和第一步相同的方法筛选出与前一结合亚位点相邻的的亚位点结
12、合的第二个小分子。筛选时第一个先导分子可以存在于体系中，也可以不在。第 4 步，与第二步类似，对第二个先导分子的类似物进行筛选，得到第二个优化的先导分子。在选定两个先导分子片段之后，用多维 NMR 技术测定蛋白质和两个配体的复合物的完整三维空间结构，得到两个配体在靶蛋白上确切的结合位置及其空间取向。第 5 步，基于上述三维结构设计恰当的连接桥将两个片段连接起来，使得到的分子和靶蛋白结合时保持各自独立时的结合位置及其空间取向，最终筛选得到一个高亲和性的配体。可以看出，该方法的基本点是首先筛选结合于生物靶分子亚活性位点的低亲和性配体，然后通过优化和组装便得到所期望的高亲和性配体。图 2SAR-by
13、-NMR 原理示意图SAR-by-NMR 成功的关键在于使用了 NMR 实验方法来辨别小分子和靶蛋白的结合，能够很快地从小分子化合物库中发现结合于靶蛋白亚活性位点的低亲和性配体。因为如果小分子和靶蛋白的结合比较弱，就需要在较高的浓度下进行测定。因为基于 15N 编辑的 NMR 技术的筛选方法，只检测 15N 标记的蛋白质的酰胺信号，而不受体系中其它组分的干扰，因此测定的结合作用也就更为可靠。相反，因为高浓度的化合物会产生大的背景信号从而干扰测定，许多传统的筛选方法（如荧光法或比色法）在测定结合较弱的配体时则常常不十分可靠。NMR 的另一优势是可以通过蛋白质特定酰胺信号的变化直接得到配体结合位点
14、的结构信息。这一点首先对辨别小分子是结合在靶蛋白的不同亚位点上非常重要，同时，通过比较结合在同一亚位点的小分子的结构，可以得到哪些官能团对结合有主要贡献的信息，然后通过结构与活性的关系对小分子进行优化。这个方法的进一步的优点是可以直接研究“变构效应”(allostericeffect） 7 ，即第一个亚位点配体存在下进行筛选时可能发现那些只有在第一个配体存在下才能和靶蛋白的其他亚位点结合的配体（图 3）。 图 3“变构效应”筛选第二个配体(三角形)只有在另一个配体(椭圆形)存在的情况下才能和靶蛋白稳定地结合。获得两个经优化的分子片段后，Fesik 等采取了“连接模式”的策略。所谓“连接模式”，
15、就是把亲和性比较弱的单个分子片段通过连接桥连接起来，这样得到的新的分子和靶蛋白结合时，将不仅仅是单个片段结合自由能的简单相加（式 1）。(1）即除了片段 A 和 B 固有的结合自由能(G A和 G B)之外，还额外得到了由于 A 和 B 连接导致的结合自由能(G link)，此项常常可以理解为片段A 和 B 连接起来后片段 A 和片段 B 同时与蛋白质结合的几率的变化，它主要可归结于熵变 12 。其结果常常是亲和性为 mM 和 M 数量级的小分子经连接可得到 nM 甚至 pM 数量级的先导化合物（图 4）。这个策略成功的关键还在于所设计的连接桥的长度 33 及其性质（如刚性 34 等）能否使
16、G link达到最优 13 。实际上“连接模式”在 LUDI 法中早有应用 2 ，和 SAR-by-NMR 不同的是在 LUDI 中完全是用从头设计的方法选择小分子片段并把它们连接起来，而在 SAR-by-NMR 中小分子片段是用NMR 直接筛选得到的。和传统的合理性设计相比，可以说，这是真正的合理性设计。图 4连接模式”获得高亲和性配体的策略按照自由能变化的原理(式 1)，通过 NMR 实验方法获得的和靶蛋白两个不同的亚位点(A 和 B)结合的低亲和性的两个分子片段(M 级和 mM 级)连接起来后得到的分子通常有高亲和性(nM 级)。SAR-by-NMR 和组合化学的相似之处是两者都须经过筛选大量化合物，都充分利用了有机化合物结构多样性的特点，从中获得高活性的先导化合物。两者的差别在于：组合化学是先制备由大量化合物组成的化合物库，然后对这些化合物库进行直接筛选；而 SAR-by-NMR 筛选的是未经“组合”（连接
