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1、 双水相萃取脂肪酶摘要：本实验主要研究用双水相萃取法分离和提纯脂肪酶的技术，探究了双水相的形成条件及不同浓度的双水相体系对脂肪酶的提纯效果。同时也介绍了一些蛋白质含量及酶活检测的基本方法。前言脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)是一种能催化长链脂肪酸甘油酯水解的酶，在生物体内是一种重要的代谢酶，在食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学以及环境、能源等领域也有非常广泛应用 12 。工业上常用的脂肪酶大多是由微生物发酵得到，但是发酵得到的只是含有杂质较多的粗酶液，要得到能够满足工业生产要求的脂肪酶还需要经过进一步的分离和纯化。现在用于脂肪酶分离纯化的方法大多是常见的蛋白质分离方法，比
2、如各种层析，电泳以及离心等方法。但是在酶的分离过程中还需要考虑到保持酶活、提高回收效率以及降低成本等因素，一般的分离方法对酶的分离提纯的效果并不很理想，所以寻找一种高效实用的提纯方法对脂肪酶在工业生产中的应用是非常重要的。双水相萃取技术是近年来基于液液萃取理论并考虑保持生物活性所开发的一种新型分离方法。是利用生物大分子物质在由高聚物/高聚物/ 水或者高聚物/无机盐/水形成的体系中的分配系数不同而实现对生物大分子的分离的。1956年，瑞典 Lund 大学的 Albertsson 首次利用双水相萃取技术来分离生物物质，研究了蛋白质、核酸、病毒、细胞及细胞颗粒在双水相体系中的分配行为，这是双水相萃取
3、方法在生物大分子分离提纯中的最早应用 3，国内对于双水相萃取方法的研究也早在 20 世纪 60 年代就已经开始了。与传统的蛋白质分离提纯方法相比，双水相萃取方法具有很多优点：体系含水量高，可达 80以上；蛋白质在其中不易变性；界面张力远远低于水有机溶剂两相体系的界面张力，一般为 0.510 -4mN*m-1，有助于强化相际间的质量传递；系统中的传质和平均速度快，能耗小，分相时间短，一般只要515min；易于放大和进行连续性操作；萃取环境温和，生物相容性高；聚合物对蛋白质的结构有稳定和保护作用等 45 。双水相萃取的方法在蛋白质、酶、核酸、氨基酸、多肽、细胞器等产品的分离和纯化等领域中得到了广泛
4、的应用。所以这种分离方法在蛋白质以及酶的分离提纯中有着很大的应用前景。现在研究最多的双水相体系有高聚物/高聚物以及高聚物 /无机盐体系，常用的高聚物有聚乙二醇（PEG）和葡聚糖等，无机盐主要有磷酸盐、硫酸盐等。本实验所采用的就是 PEG/硫酸盐体系，另外对于一种不是很常见的双水相体系表面活性剂双水相体系也做了一些探究。一、 实验原理：双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两种物质所形成的双水相中的分配系数的不同而进行分离的。当双水相体系中的两种物质浓度达到一定比例时，就会形成两个稳定的且互不相溶的两相，由于脂肪酶在这两相中的分配系数不同，就会自动的向分配系数高的一相中移动，而其它的杂质则分配
5、到另一相，这样就达到了分离提纯的目的。由于两相都是水相，所以一般对于酶的活性及稳定性不会有太大的影响。为了得到适合的两相配比，就要通过绘制相图来进行分析，相图的绘制就是通过调整两相比例，得到能够分相的临界点，从而得到相图。蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，利用考马斯亮蓝进行染色，然后检测吸光度，对照标准曲线即可得到蛋白质含量。酶活的检测方法则有滴定法和 pNPP 法，滴定法是以橄榄油乳化液为底物，通过检测脂肪酶水解橄榄油得到的脂肪酸来确定其活性。而 pNPP 法则是利用脂肪酶水解 4-硝基苯基磷酸二钠盐（pNPP ）得到有颜色的对硝基苯酚（pNP） 11，然后通过分光光度计检测其吸光度，对照标
6、准曲线得到酶活。脂肪酶经过双水相的初步分离后，还要通过凝胶过滤的方法对其进行进一步的分离和纯化，从而达到更高的纯度。但是经过双水相后，体系中有大量的 PEG（脂肪酶主要分配在 PEG 相）从而不能直接经过凝胶过滤，还需要采取一定手段去除过量的 PEG，可以采用 PEG 沉淀的方法或者反萃取来去除多余的PEG。本实验采用的是 PEG/（NH 4） 2SO4 体系和 SDS/CTAB 体系两种双水相。PEG/（ NH4） 2SO4 体系是较为常用的一种双水相体系，以前也有人做过相关的研究，证明这种体系对于脂肪酶的分离提纯效果比较好 68 。SDS/CTAB 体系是一种表面活性剂双水相体系，国内也有
7、对此类双水相体系的分配行为及在蛋白质及氨基酸等大分子物质的分离提纯中的应用，但并没有人将其用于脂肪酶的分离提纯 9-10。二、 实验用品：实验材料：假单胞菌脂肪酶（由假单胞菌发酵制备）实验仪器：紫外可见分光光度计，离心机，乳化机，恒温摇床，恒温水浴锅，PH 计实验药品及配制方法：PEG1000， （NH 4） 2SO4，十二烷基硫酸钠（ SDS） ，十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） ，橄榄油，2%聚乙烯醇（PVA）溶液，糊精，蛋白胨， K2HPO43H2 O，MgSO 47H2 O，0.05mol/L NaOH 溶液，酚酞指示剂，EDTA,pNPP,乙腈Tris-HCl（PH8.5）：称取 6
8、.055gTris-HCl，溶于约 800ml 蒸馏水中，用 HCl 调节 PH 至 8.5，定容至 1000ml 即可。橄榄油乳化液：将 2%PVA 溶液与橄榄油按 3：1 的比例进行混合，在乳化仪上以 3000r/min 的速度乳化，每次 3min，重复乳化 3 次。发酵培养基：0.5糊精；1.5蛋白胨；0.18K 2HPO43H2O；0.07%MgSO 47H2O；0.14 尿素；2橄榄油乳化液，调节 PH8.4 左右，接种量 2。考马斯亮蓝：考马斯亮蓝 G250 100mg 溶于 50ml 95%乙醇，加入 100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至 1000ml,抽虑出去杂质。最
9、终试剂中含 0.01%（W/V）考马斯亮蓝 G250,4.7%（W/V）乙醇，8.5% （W/V）H 3PO4。标准蛋白溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同 0.15mol/LNaCl 配制成 100ug/ml 蛋白溶液。pNPP 底物：将 pNPP 溶于乙腈中使终浓度为 10mmol/L,依次加入乙醇和50mmol/L Tris-HCL 缓冲液（PH8.5） ，使乙腈、乙醇、Tris-HCl 体积比为1：4：95。由于该溶液很不稳定，需要现配现用，保存时则是不加 Tris-HCl,置于-20下保存。三、 实验方法：1. 双水相相图的制作 12-13：PEG
10、/（NH 4） 2SO4 体系双水相相图制作方法：根据 Albertsson 的方法绘制相图：取一定量的 40的 PEG 原液置于试管中，然后加入 40的硫酸铵原液，混合直至试管中出现沉淀为止，记录加入的硫酸铵的量，再加入适量的水，使体系变得澄清，记录所加入的水，并继续加入硫酸铵使系统再次变混浊。如此反复操作，计算达到混浊时 PEG 与硫酸铵在体系中所占的质量百分数，以硫酸铵的质量分数为横坐标，以 PEG 浓度为纵座标即可得到相图的双节点曲线。表面活性剂双水相体系相图的制作方法：分别配制浓度为 0.05mol/L 的 CTAB 和 SDS 溶液计算其质量分数，做为纯组分，分别占据三元相图的两个
11、顶点，以水作为另一个顶点。在三元相图上均匀的取点，按规定浓度混合配制样品在一定温度下恒温一段时间（具体时间待定） ，观察其分相情况，记录分相时间及组成，绘制三元相图。2. 粗酶液的制备：按上述配方配制假单胞菌发酵培养基 100ml，分装到 2 个 250ml 锥心瓶中，灭菌后向每瓶中分别接种 1ml 活化后的假单胞菌种，置于 28左右的摇床中培养 60h，将所得溶液在 4000r/min 条件下离心 10min，取上层清液即为所需的粗酶液。3. 双水相萃取脂肪酶：PEG/（NH 4） 2SO4 双水相体系：先将 PEG1000 和（NH 4） 2SO4 分别配制成质量分数为 50%和 40%两
12、种浓度，然后按照一定的比例混合，保证体系中的 PEG1000 质量分数分别为15%， 20%， 25%；（NH 4） 2SO4 质量分数分别为 15%，20%，25%的浓度，即有 9 组不同的体系进行实验。取上述 9 种体系 8g 置于 10ml 刻度试管中，向其中加入 2g 粗酶液，静置 15min 左右，观察分相情况并记录上下相体积比。分别取出上下相溶液留待后面实验使用。SDS/CTAB 双水相体系：分别配制 0.05mol/L 的 CTAB 和 SDS 溶液，并按1.5：1，1.75：1，1：1，1：1.75，1：1.5 等浓度比混合，使其形成 5 种不同的双水相体系，在不同的水浴温度下
13、进行实验，研究温度以及体系配比对于表面活性剂双水相体系萃取效果的影响。4. 蛋白质含量测定：本实验采用的蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，先用标准牛血清蛋白制作标准曲线，用分光光度计检测 595nm 处的吸光度，并对照标准曲线即可得到体系中蛋白质含量（若测得吸光度值过高可稀释后再测） 。5. 酶活检测：滴定法测酶活：向 50ml 锥形瓶中加入 5mlTris-HCl(PH8.5),4ml 橄榄油乳化液在 45水浴锅中预热 45min，加入脂肪酶液 1ml，在 45水浴锅中反应 10min，反应完后立即用 15min 中止液（乙醇-丙酮 1：1 混合液）中止反应，向反应后溶液中加入酚酞指示剂，用
14、 0.05mol/LNaOH 进行滴定，对照组为加入脂肪酶液后不反应而立即中止，酶活的定义为单位时间内所产生脂肪酶的量，计算公式为（实验组-对照组） 10。pNPP 法测酶活：取 4mlpNPP 底物置于 45水浴锅中预热 5min，加入 50l 稀释后的酶液，在 45下反应 5min 后，加入 10l 的 0.05mol/L EDTA 溶液后立即放入冰水中中止反应。用紫外可见分光光度计测定 405nm 波长处的吸光度，根据所产生的对硝基苯酚（pNP）浓度来计算酶活。单位酶活定义为 45下，PH8.5 时每分钟分解 pNPP 并释放 1l 对硝基苯酚所需酶量。6. PEG 沉淀：取双水相体系中
15、的上相溶液（PEG 相，脂肪酶主要分布于上相） ，分别向其中加入 PEG，使体系中 PEG 质量分数分别为 20%，30%,40%,50%,60%等，室温下静置 10h 以上，8000r/min 离心，收集沉淀并溶于蒸馏水中，留待层析时使用。7. 分子筛层析纯化脂肪酶：层析方法参考课件，所使用的凝胶为实验室中用于纯化脂肪酶的葡聚糖凝胶。四、 实验结果及讨论:1. 双水相相图：PEG/（ NH4） 2SO4 双水相体系：实验中加入（NH 4） 2SO4 以及水的量如下表：（初始加入 PEG 量为 5ml）（NH4）2SO4/m 650 190 220 260 260H2O/m 400 400 4
16、00 400 200（NH4）2SO4/m 140 160 140 160 140H2O/m 200 200 180 200 180（NH4）2SO4/m 140 140 130.5 100 120H2O/m 180 150 150 150 100（NH4）2SO4/m 40 110.5 100 100 65H2O/m 100 100 100 100 100（NH4）2SO4/m 80 80 95 90 95H2O/m 100 100 100 100所得的相图如下：PEG/（ NH4） 2SO4 相 图05101520253035404 7 8 9 9 10 10 10 11（ NH4） 2SO4/(%)PEG/(%)SDS/CTAB 双水相相图：该相图为三角形相图，引用自文献12。在实验中我们发现在室温下基本无法分相，而且很多都凝成了固体装物质，无法摇动，在 45水浴下也只有 3
