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1、51041300069 刘 欢血 清 蛋 白 质 的 分 离 纯 化 与 鉴 定刘 欢 1 张 唯 2 赵 澜 2 彭 垠 婷 2 徐 波 2 郭 小 李 2(1 生 化 专 业 细 胞 生 物 学 51041300069 导 师 ： 张 红 锋 ;2 华 东 师 范 大 学 生 命 科 学 学 院 )摘 要 ：通 过 系 统 的 生 化 制 备 与 分 析 实 验 ，让 学 生 基 本 掌 握 了 包 括 脱 盐 、亲 和 层 析 、醋 酸 纤 维 薄 膜 电 泳 、SDS-PAGE、HPLC 和 冷 冻 干 燥 在 内 的 生 化 技 术 。从 而 为 以 后 的 科 研 工 作 打 好
2、基 础 。关 键 词 ：层 析 ；电 泳 ；SDS-PAGEAbstract:By doing biochemichal preparing and analyzing experiment, technologies such as protein concentration detecting,enzyme activity testing, chromatography, acetate green electrophoresis, HPLC ,SDS-PAGE and other biotechnological techniques are mastered. Students ar
3、e made qualified to their research work.Keywords: chromatography ; electrophoresis ; SDS-PAGE一 、 前 言生 命 物 质 的 制 备 和 分 析 是 现 代 生 物 化 学 中 必 不 可 少 且 又 非 常 实 用 的 技 术 。 本 实 验 通 过 对 兔血 清 蛋 白 的 分 离 ， 让 我 们 基 本 掌 握 常 用 的 技 术 ， 初 步 了 解 了 纯 化 技 术 的 整 体 步 骤 和 整 个 生 化 技术 的 整 体 流 程 ， 为 我 们 以 后 自 己 分 离 纯 化 蛋 白 质
4、产 物 建 立 了 一 个 基 本 的 概 念 ， 以 及 为 以 后 的 研究 工 作 打 下 基 础 。 这 些 技 术 都 是 常 用 而 成 熟 的 技 术 ， 但 是 一 个 多 世 纪 以 来 ， 尽 管 生 物 技 术 有 了飞 速 发 展 ， 它 们 仍 一 直 在 发 挥 着 重 要 的 ， 不 可 替 代 的 作 用 。 这 些 技 术 包 括 ：（ 一 ） 蛋 白 质 检 测 技 术 电 泳 技 术Hardy1， 2， 3发 现 ， 许 多 生 物 胶 体 ， 如 蛋 白 质 、 酶 等 有 特 征 的 电 泳 迁 移 率 （ electrophoretic mobili
5、ties） 。 此 迁 移 率 在 很 大 程 度 上 取 决 于 溶 液 的 pH。 因 此 利 用 电 泳 特 征 作 为 对 物 质 的 鉴 定 引 起人 们 广 泛 的 兴 趣 。 20 世 纪 的 20 年 代 和 30 年 代 ， 电 泳 理 论 和 实 践 有 了 很 大 的 发 展 。 Tiselius 教 授 首先 证 明 了 血 清 是 由 白 蛋 白 ， 、 和 球 蛋 白 组 成 的 4。 人 血 清 蛋 白 用 界 面 移 动 方 法 分 离 的 最佳 条 件 是 0.1mol/L（ pH8.6） 的 巴 比 妥 缓 冲 液 ， 此 时 白 蛋 白 具 有 最 快 的
6、 迁 移 速 度 ， 接 着 依 次 为 1、 2、 和 球 蛋 白 58。生 物 大 分 子 如 蛋 白 质 、 核 酸 、 多 糖 等 常 以 颗 粒 分 散 在 溶 液 中 ， 它 们 的 净 电 荷 取 决 于 介 质 的H+浓 度 或 与 其 他 大 分 子 的 相 互 作 用 。 在 电 场 中 ， 带 电 颗 粒 向 阴 极 或 阳 极 迁 移 ， 迁 移 的 方 向 取 决于 它 们 带 电 的 符 号 ， 这 种 迁 移 现 象 即 所 谓 电 泳 。 迁 移 的 方 式 目 前 可 分 为 三 类 ： 根 据 分 子 尺 寸 大小 、 分 子 所 带 的 电 荷 或 分 子
7、 的 生 物 学 与 化 学 特 征 。 电 泳 迁 移 率 （ mobility） m 规 定 为 在 电 位 梯 度 E的 影 响 下 ， 颗 粒 在 时 间 t 中 的 迁 移 距 离 d。聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 （ plyacrylamide gel,PAG） 是 由 丙 烯 酰 胺 （ acrylamide） 和 交 联 试 剂 N,N -甲叉 双 丙 烯 酰 胺 （ N,N -methylenebisacrylamide） 在 有 引 发 剂 和 增 速 剂 的 情 况 下 聚 合 而 成 的 。 聚 丙烯 酰 胺 的 单 体 形 成 长 链 ， 由 N,N -甲 叉 双 丙
8、烯 酰 胺 的 双 功 能 基 团 和 链 末 端 的 自 由 功 能 基 团 反 应51041300069 刘 欢而 发 生 交 联 。 其 化 学 结 构 已 经 清 楚 9。聚 丙 烯 酰 胺 的 特 性 ， 包 括 其 机 械 性 能 、 弹 性 、 透 明 度 、 粘 着 度 以 及 孔 径 大 小 均 取 决 于 两 个重 要 的 参 数 T 和 C。 T 是 两 个 单 体 的 总 百 分 浓 度 。 C 是 与 总 浓 度 有 关 的 交 联 百 分 浓 度 。 Hjerten 教授 10在 1962 年 引 入 以 下 两 个 公 式 来 进 行 计 算 。T=(a+b)/m
9、100(%)C=b/(a+b)100(%)A 为 丙 烯 酰 胺 的 克 数 （ g） ， b 为 N,N -甲 叉 双 丙 烯 酰 胺 的 克 数 （ g） ， m 为 水 或 缓 冲 液 的 终 体积 （ ml） 。 其 中 a 和 b 的 比 例 是 很 重 要 的 11。PAGE 电 泳 根 据 原 理 ， 需 要 在 以 下 方 面 做 选 择 ：1) pH 的 选 择 考 虑 原 则 有 ： 合 适 的 分 离 胶 缓 冲 系 统 、 先 导 离 子 、 尾 随 离 子 、 浓 缩 胶 缓 冲系 统 、 反 向 离 子 及 电 泳 缓 冲 液 12,13。2) 离 子 强 度 的
10、选 择 。 一 般 来 说 ， 离 子 强 度 在 0.010.1mol/L14,最 常 用 的 为 0.05mol/L15。3) 凝 胶 浓 度 的 选 择 。 浓 度 太 大 则 孔 径 较 小 ， 样 品 留 在 加 样 位 置 ； 太 小 则 不 能 很 好 分 离 。所 以 必 须 通 过 实 验 来 选 择 最 佳 的 浓 度 。4) 分 子 量 的 测 定 。1964 年 Feerguson16首 先 在 淀 粉 凝 胶 中 证 明 了 蛋 白 质 分 子 的 迁 移 率 m 的 对 数 或 相 对 迁 移 率Rf 的 对 数 对 凝 胶 浓 度 T%作 图 ， 可 以 得 到
11、一 条 直 线 。 这 个 现 象 接 着 在 1968 年 由 Hedrick 和 Smith 17在 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 证 实 。SDS-PAGE 技 术 首 先 在 1967 年 由 Shapiro18等 建 立 ， 1969 年 由 Weber 和 Osborn19进 一 步 完善 。 他 们 发 现 在 样 品 介 质 和 聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 中 加 入 离 子 去 污 剂 和 强 还 原 剂 后 ， 蛋 白 质 亚 基 的 电泳 迁 移 率 主 要 取 决 于 亚 基 分 子 量 的 大 小 ， 而 电 荷 因 素 可 以 被 忽 略 。SDS 是 一 种 阴
12、 离 子 去 污 剂 ， 作 为 变 性 剂 和 助 溶 性 试 剂 ， 它 能 断 裂 分 子 内 和 分 子 间 的 轻 键 ，使 分 子 去 折 叠 ， 破 坏 蛋 白 质 分 子 的 二 级 和 三 级 结 构 。 强 还 原 剂 ， 如 巯 基 乙 醇 （ -mercaptoethanal） 和 二 硫 苏 糖 醇 （ dithiothreitol, DTT） 则 能 使 半 胱 氨 酸 残 基 之 间 的 二 硫 键 断 裂 ， 消除 了 分 子 间 原 有 的 电 荷 差 异 。（ 二 ） 蛋 白 质 的 分 离 提 取蛋 白 质 是 一 种 极 具 多 相 性 的 生 物 大
13、分 子 ， 离 开 其 天 然 环 境 ， 蛋 白 质 分 子 极 不 稳 定 ， 在 细 胞中 和 抽 提 液 中 的 蛋 白 质 的 性 状 也 不 尽 相 同 。 蛋 白 质 有 多 种 类 型 ， 通 过 不 同 的 方 法 我 们 可 区 分 为可 溶 性 蛋 白 、 膜 结 合 蛋 白 、 具 有 催 化 功 能 的 蛋 白 或 结 构 蛋 白 及 转 录 调 节 蛋 白 。从 正 常 生 物 基 质 中 提 取 各 种 蛋 白 质 均 需 要 有 特 定 的 条 件 。 如 果 不 能 满 足 这 一 条 件 ， 蛋 白 将很 快 的 失 去 生 物 学 活 性 ， 其 生 物
14、半 衰 期 也 将 迅 速 降 低 。 因 此 ， 在 蛋 白 质 的 特 性 研 究 中 ， 确 定 提取 条 件 是 一 个 关 键 问 题 。 在 不 同 实 验 中 遇 到 的 困 难 也 各 不 相 同 ， 有 些 式 样 中 的 困 难 是 如 何 维 持酶 的 活 性 。 在 不 同 实 验 中 要 针 对 不 同 的 情 况 来 解 决 不 同 的 问 题 。 然 而 对 蛋 白 质 研 究 而 言 却 有 着一 些 共 同 的 参 数 。1).缓 冲 液 。 缓 冲 液 可 以 抗 衡 蛋 白 质 溶 液 中 的 pH 值 的 改 变 ， 选 择 合 适 的 缓 冲 液 对
15、于 维 持 一 定pH 值 下 蛋 白 质 的 稳 定 及 保 证 实 验 的 重 复 性 十 分 重 要 20,21。a. 应 对 pKa 相 近 的 一 些 缓 冲 液 进 行 实 验 ， 以 避 免 有 的 缓 冲 液 与 所 研 究 的 蛋 白 质 之 间 发51041300069 刘 欢生 不 良 的 相 互 作 用 22。b. 当 选 定 一 种 缓 冲 溶 液 后 ， 一 般 使 用 其 最 低 的 浓 度 以 避 免 非 特 异 性 的 离 子 强 度 的 影 响 。通 常 以 50mmol/L 的 缓 冲 液 浓 度 作 为 实 验 的 起 始 浓 度 。c. 当 缓 冲 液
16、 pKa 值 的 变 化 超 过 一 个 1pH 单 位 时 其 有 效 的 缓 冲 能 力 明 显 降 低 。 而 许 多 酶在 极 限 pH 值 时 往 往 发 生 不 可 逆 的 变 性 23。d. 大 多 数 动 物 细 胞 在 37 的 生 理 状 况 下 的 pH 值 为 7.07.5， 而 在 温 度 下 降 至 接 近 0 时可 达 8.024。e. 要 根 据 所 选 用 的 分 离 方 法 选 用 缓 冲 溶 液 ： 凝 胶 过 滤 方 法 大 多 数 缓 冲 液 均 可 适 用 。 阴离 子 交 换 层 析 ， 阳 离 子 缓 冲 液 首 选 Tris 缓 冲 液 。 阳 离 子 交 换 和 羟 基 磷 灰 石 层 析 ， 阴 离子 缓 冲 液 首 选 磷 酸 盐 缓 冲 液 22。f. 混 合 缓 冲 液 在 一 定 的 离 子 强 度 下 往 往 具 有 更 宽 的 缓 冲 范 围 25
