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1、附件 1吉林省高校优秀科研成果评审书（科学技术类）申报评奖项目名称： 貂心及其制剂的指纹技术研究 所 属 学 科： 药物分析 申 报 单 位： 北华大学 项 目 主 持 人： 张丽华 项 目 完 成 时 间： 2010.11 项 目 是 否 保 密： 否 吉林省教育厅二一年十月1一、项目简介项 目 名 称 貂心及其制剂的指纹技术研究申 报 单 位 北华大学完 成 单 位 北华大学项目主持人 张丽华项目成果类别 技术创新项目来源及编号 吉林省教育厅“十一五” 科学技术研究项 目，吉教科合字2008 第 132 号组织鉴定单位（评价机构）吉林省教育厅项目联系人 张丽华 联系电话 186044986
2、19；186044986202（项目所属学科技术领域、主要技术内容、特点及 应用推广情况）貂心属细贵药材，是国家药监局局标准（原卫生部部颁标准）利心丸和定心丹中的主药。两个品种一直是补心安神、治疗风湿性心脏病、心动过速、心律不齐和心力衰竭等症之良药，因其疗效好，深受患者欢迎。目前，国家标准中尚无貂心的法定鉴别方法，对貂心的成分研究及鉴别国内外文献中也未见报道，故给貂心及其制剂的质量控制带来了很大困难。因此，常使貂心货源不足而断档，不法商贩也趁机以假乱真，搞乱市场，常出现伪、劣品，致使貂心真货价格昂贵，经常是供不应求，也给含貂心的制剂质量控制增加了难度。本课题采用了 TLC、AES、IR、DNA
3、、扫描电镜等现代指纹技术对貂心及其制剂进行系统的鉴定、分析研究，找出貂心及其制剂的各类指纹特征，为貂心的内在质量控制提供了科学依据。 同时也为含貂心制剂的品种能走出国门提供了可靠的质量监控技术。本课题应用分子生物学方法，首次探讨了中药利心丸中貂心的分子遗传学鉴定技术。构建了貂种酶切的指纹特征图谱，为今后貂心的遗传和进化的研究、物种的鉴别等工作提供了重要数据。本研究还利用 mtDNA 独特的优势，应用 PCR 及 RFLP 技术，研究了貂心线粒体 DNA 的基因库，为貂心种质资源的保护利用及鉴定提供了科学的理论依据。所研制的貂心 DNA 标准指纹特征图谱已应用于药品监督部门和制药企业的生产质量监
4、控中。建立的方法能准确、快速地进行定性、定量检测。上述研究所取得的阶段性成果已发表论文 6 篇；其中：重要期刊 3 篇，核心期刊 2 篇；被 ISTP 收录的国际会议论文 1 篇。 在该课题研究的同时，在课题及其相关领域申报了发明专利 4 项，其中 1 项已授权，1 项已进入公示阶段。貂心 DNA 检测试剂盒的研制正在进行中，研究成果一旦应用，必将获得巨大的经济效益和社会效益。DNA 指纹特征的研究成功，可有利促进中药现代化的发展进程，对中药的标准化研究有重大的推动作用，是一个具有开发前景的项目。所选取的貂心品种的 DNA 指纹检测试剂的研究，目前在国内外文献中还未见报导。该品种 DNA 指纹
5、试剂盒的开发和应用，将获得较大的经济效益和社会效益。二、项目内容介绍（包括立项背景；详细科学技术内容；发现、发明及创新点；保密要点；应用、推广及论文发表、收录、引用情况。 ）3立项背景我国中药制剂品种和剂型繁多，因其疗效确切，应用范围较广。但因所含药味多，处方剂量大，故用现已知的几个单一成分作为质量控制指标，实难真正地反应出中药制剂的内在质量，由于大部分中药的有效成分未被阐明或部分阐明，因此，仅对某个有效成分或指标性成分进行定性、定量分析，不能有效控制中药及其制剂的质量，从而影响了中药及其制剂走向世界的进程。 貂心属细贵药材，是国家药监局局标准（原卫生部部颁标准）利心丸中的主药。利心丸一直是补
6、心安神，治疗风湿性心脏病、心动过速、心律不齐和心力衰竭等症之良药，该药也因其疗效好而深受患者欢迎。目前，国家标准中尚无貂心的法定鉴别方法，对貂心的成分研究及鉴别国内外文献中也未见报道，常用中药材鉴别方法无法区别貂心与易混动物的心脏，故给貂心及其制剂的质量控制带来了很大困难。貂心与其伪品（鸡心、鸭心、鹅心、兔心等）的鉴别已成为利心丸质量标准控制的关键步骤。现代研究证明，貂心含有丰富的三磷腺苷、细胞色素 C 及心房肽，与其它动物心脏性状特点、理化性质等相同。在利心丸中，貂心是以干粉的形式与其它药（其它成分在药典中是保密的）配伍混合在一起的，由于貂心缺乏明显的形态鉴别特征和特殊的化学成分，因此传统的
7、鉴定方法在貂心的鉴定中是十分困难的。分子遗传学标记技术为中药材与易混品种的鉴别提供了一条新的途径。线粒体细胞色素b（cytb）基因进化速度适中，是分析种内、种间遗传多样性和进化关系的适当的 DNA 片段，可应用于生物的分类、系统发育和遗传多样性的研究。本研究利用 mtDNA 独特的优势，应用 PCR 技术研究貂心线粒体 DNA 的基因库，为貂心种质资源的保护利用及鉴定提供了科学理论依据。将分子生物学的方法应用于鉴定貂心组织中，即将 DNA 指纹特征图谱的鉴定方法应用于中药材及其伪品的鉴定中，是药检技术方面的有力而必要的补充，同时基于 DNA 分析技术的分子鉴定方法也可成为中药四大鉴定方法（基原
8、鉴定、性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定）的重要补充，也可为中药鉴定技术开辟了一片新的领域。详细科学技术内容本课题采用分子生物学的方法，对貂心及其伪品的 DNA 进行了指纹特征研究，通过采用碱变性的方法提取貂心及其易混的动物组织心脏中的 mtDNA，采用 Primer Premier 5.0 引物设计软件设计出貂心的特异性引物并进行 PCR 特异性扩增，寻找出了貂心的最适退火温度，通过扩增出的1 100 bp 的貂心特异性条带，得到了貂心 DNA 的指纹特征图谱，该特征与其伪品鸡心、鸭心、鹅心、兔心的谱图有明显区别。同时，我们成功地从貂心的干粉组织中提取出了 mtDNA，并且用貂心的特异性引物对貂心
9、的干粉组织进行扩增，从电泳图中可见新鲜的貂心组织与干粉组织的PCR 图在同一位置均有相应的条带，实现了从分子水平上对貂心（貂心新鲜组织和貂心干粉组织）进行鉴定及分析，且方法简便，结果可靠。1、研究方法对易混品种貂心线粒体 DNA（mtDNA）的提取及纯化；mtDNA 序列测定及特异指纹图谱建立；生物信息学确定中药易混品种保守且特异的指纹区段；设计特异引物，建立 PCR（聚合酶链式反应）反应体系；开发 DNA 指纹检测试剂盒。2、技术路线貂心线粒体 DNA（mtDNA）提取4mtDNA 序列测定及特异指纹图谱建立生物信息学确定貂心保守且特异的指纹区段生物信息软件设计引物，建立 PCR 反应体系制
10、作 DNA 检测试剂盒，对貂心及易混品种进行鉴定应用、推广及论文发表、收录、引用情况所研制的“貂心 DNA 标准指纹特征图谱”已应用于药品监督部门和制药企业的生产质量监控中。建立的方法能准确、快速地进行定性、定量检测。该课题研究所取得的阶段性成果已发表论文 6 篇；其中：重要期刊 3 篇，核心期刊 2 篇；被 ISTP 收录的国际会议论文 1 篇。1、应用单位目录：应用单位名称 联系人 联系电话 应用起始时间（1）吉林国药制药有限责任公司 李荣杰 15944258625 2009.4至今（2）四平市食品药品检验所 赵 磊 15504341520 2009.1至今（3）吉林市食品药品检验所 金英
11、兰 13844242877 2009.3至今2、发表论文情况(1) 貂组织线粒体 DNA 及细胞色素 b 鉴定及特征 2008.5 吉林大学学报 张丽华（第一作者）(2) 水貂心肌线粒体 mtDNA 鉴定及 RFLP 特征 2008.11 中国药学杂志 张丽华（第一作者）(3) ICP-AES 法测定貂心中金属元素 2008.12 中药材 张丽华（第一作者）(4) Application Of Molecular Biology Techniques on The Identification of Martes Zibellina L. Hearts And its Counterfeits
12、（2009 INTERNATIOANL CONFERENCE OF NATURAL PRODUCTS AND TRADITIONAL MEDICINE） （ISTP 收录） 张丽华（第一作者）(5) 貂心与其伪品的脱氧核糖核酸指纹特征研究 2010.4 时珍国医国药 张丽华（通讯作者）三、项目成果所取得的学术价值、经济效益、社会效益及申请、获得专利5情况。学术价值目前，国家标准中尚无貂心的法定鉴别方法，对貂心的成分研究及鉴别国内外文献中也未见报道，常用中药材鉴别方法无法区别貂心与易混动物的心脏。该项目中“貂心的 DNA 指纹鉴定特征” 研究成果在国内外文献中未见报道，属国内首创，特别是填补了貂
13、心鉴定的空白，故具有良好的应用前景。该课题的研制成功，将对中药及其制剂的标准化研究起到重要的推动作用，对未来中药及其制剂的方法学研究提供重要的技术支持，为我国国药能走出国门奠定了基础。一旦应用必将获得较大的社会效益和经济效益。经济、社会效益本课题应用了 DNA 指纹技术，对目前市场上难以鉴定的貂心进行了系统的研究，制定出了能有效控制该品种质量的 DNA 检测方法，获得了满意效果。该方法可从根本上解决貂心及其制剂以假乱真、以次充好的市场混乱现象，从而保障广大人民群众的用药安全。上述貂心 DNA 指纹特征的研究成功,可有利促进中药现代化的发展进程，对中药的标准化研究有重大的推动作用。貂心DNA 指
14、纹试剂盒的开发和应用，将为易混品种的鉴定提供一崭新的领域。申请、获得专利情况在该课题研究的同时，在课题及其相关领域申报了发明专利 4 项，其中 1 项已授权，1 项已进入公示阶段。貂心 DNA 检测试剂盒的研制正在进行中，研究成果一旦应用，必将获得巨大的经济效益和社会效益。知识产权授权情况1、貂心 DNA 检测试剂盒及鉴定方法（已授权） 授权号： ZL200810051643.3 李明成，张丽华，王冰梅2、中药 DNA 检测试剂盒及鉴定方法（已公示） 申请号： 200810051642.9 张丽华，李明成，王冰梅四、评审意见6申报单位审查推荐意见要求申报单位对推荐内容及全部附件材料进行了审查，并对材料及附件的真实性负责。负责人： （公 章）年 月 日 学科专家评审组意见组 长： 年 月 日吉林省高校优秀科研项目评审委员会意见 主 任： （公 章）年 月 日7五、 附件目录1、主要完成人员情况表2、项目结项书及相关成果复印件。（1）项目结项书3、技术评价证明。（1）吉林省科技成果登记证书4、应用证明。（1）吉林国药制药有限责任公司应用证明（2）四平市食品药品检验所应用证明（3）吉林市食品药品检验所应用证明5、查新报告或国家发明专利证书及发明权利要求书。（1）貂心 DNA 检测试剂盒及鉴定方法（已
