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1、牛乳中的嗜冷菌对乳制品品质的影响嗜冷菌及其来源途径1.1牛乳及乳制品中的主要嗜冷菌在乳品工业界“嗜冷菌” 被定义为能够在 7以及更低温度条件下生长繁殖，不论其最适生长温度条件是多少的一类微生物。在刚挤出的鲜乳中嗜冷菌数量占细菌总数的不到 10%；而在冷藏条件下，嗜冷菌快速生长繁殖而成为牛奶中种群数量占优势的微生物菌群。在牛乳中发现的最常见的嗜冷菌为假单胞菌属（Pseudomonas ） ，特别是荧光假单胞菌（Ps.fluorescens ） 。有人统计了 1960 年1970 年整个十年期间原料乳和乳制品中嗜冷菌的种类及其出现率，其结果表明假单胞菌属占嗜冷菌总数中的绝大部分，同时也存在有芽孢杆
2、菌属（Bacillus） 、微球菌属（Micrococcus） 、埃希氏菌属（Escherichia） 、黄杆菌属（Flavobacterium） 、肠杆菌属（Enterobacter） 、产碱杆菌属（Alcaligenes）等1 1.2来源嗜冷菌在自然界中无处不在，它广泛存在于牛乳的外部环境如土壤、灰尘、空气、水、草料、粪便等当中，但在奶牛乳房内很少发现。因此，在牛乳房表面、不清洁的挤奶器内和运送牛乳的无缝不锈钢管道及其阀门很可能存有嗜冷菌的污染源。特别是设备停车期间，在存在污染源的部位嗜冷菌利用残存牛乳生长和大量繁殖，当设备开始运行时流经该部位的牛乳便被嗜冷菌污染。嗜冷菌产生的蛋白酶嗜冷菌
3、产生的蛋白酶是微生物为了消化酪蛋白而分泌的胞外降解性酶类,有三种形式,即胞内蛋白酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶。Keogh 曾报道 UHT 奶发生胶凝与嗜冷菌产生的胞内蛋白酶有关。目前的研究集中于胞外蛋白酶，其多数属耐热的碱性金属蛋白酶，Zn2+和Ca2+是酶活性中心，对热处理有非常高的稳定性；最适的温度和 pH 分别是 3040和68。嗜冷菌胞外蛋白酶耐热的机理在于经过高温处理后，未被破坏的处于非折叠状态的蛋白酶分子（无活性）重新折叠成有活性的天然构象2 。因此生奶中一旦产生此类酶后无法通过单一的热处理完全灭活，即能够耐受巴氏灭菌（72/15s）和超高温（UHT）（120150/0.58s）灭菌
4、工艺处理，引起牛乳腐败变质，给乳品加工企业提出一个大的难题。由假单胞菌 PM26（Pseudomonas PM26）分泌的蛋白酶经过 75/10min 的热处理后仍保持有 75%的活性；有 6 株假单胞菌分泌的蛋白酶在经过 121/10min 的热处理后仍有活性。料乳中所含的大约 7090%嗜冷菌能分泌热稳定的蛋白酶。多数嗜冷菌产生的胞外蛋白酶对 4070的热处理非常敏感，此现象被称为低温失活。如一些嗜冷菌分泌的蛋白酶在 55的温度条件下长时间加热处理易被失活。假单胞菌MC60（Pseudomonas MC60）所分泌于脱脂原料乳中的蛋白酶经过 55/60min 的热处理后活性失去 96.8%
5、，但是 60/h 或 50/h 的热处理不会使其失去活性。55的低温处理是非常有益的，不但可以使热稳定的蛋白酶失去活性，而且在此温度条件下处理牛乳，不会对牛乳的品质造成任何负面影响。55的热处理使牛乳中蛋白酶失活，可能原因是在热处理条件下酶分子的螺旋结构解体变得松散，引起酶活性的可逆性的丧失，当酶处于这个阶段时非折叠状态的酶分子被天然构象的酶分子所分解，即被其它在这个温度条件下热处理不变性的蛋白酶分解，从而失去活性。牛乳酪蛋白中的 -酪蛋白的降解将会导致酪蛋白胶束聚集和凝胶沉淀，嗜冷菌蛋白酶起到类似于凝乳酶的作用。3嗜冷菌分泌的脂酶牛乳中的脂酶中有一部分是微生物分泌的水解乳脂的一类酶。嗜冷菌分
6、泌的脂酶常常是热稳定的、同时又能引起牛乳产生酸败和苦臭味。脂酶对脂类的降解不像蛋白酶对蛋白质的降解那样占有决对优势。假单胞菌属是牛乳中降解脂类的主要菌群，同时气单胞菌属、无色杆菌属、黄杆菌属等也能分泌脂酶。不同嗜冷菌菌株分泌的脂酶耐热性能不同。黄杆菌分泌的脂酶与假单胞菌和气单胞菌分泌的脂酶相比较，前者具有较差的耐热性能3 。部分嗜冷菌分泌的脂酶能耐受 130/15s 的热处理。荧光假单胞菌 MC50 分泌的脂酶在经过使产品达到商业无菌的热处理工艺后能存活下来。巴氏灭菌和超高温灭菌工艺处理后的结果分别是使牛乳中的 75%和 91.6%的脂酶丧失活性。牛乳中的嗜冷菌含量与热加工处理后脂酶活性的残存
7、量呈正相关。牛乳中存在的一个最重要的脂酶是卵磷脂脂酶，它能水解乳脂肪球外面具有保护作用的膜。这一层具有保护作用的膜主要成分是卵磷脂，它维持着牛乳中脂肪的球状。脂肪球膜的水解导致牛乳中脂肪的上浮聚集，更易于被嗜冷菌分泌的脂酶水解。经此酶作用后牛乳及其制品便会产生臭味。如果牛乳脂肪球膜不会破坏，那么牛乳中的脂肪就不会被脂酶所作用而分解。这或许是解释热处理牛乳出现酸败特别少的原因。牛乳中固有的脂酶可能比牛乳中的嗜冷菌产生的脂酶对牛乳及制品的质量影响更大。4对产品质量的影响牛乳和乳制品最常见的风味缺陷水果味和酸败味，是牛乳中含有的大量的嗜冷菌对牛乳中的组成成分作用后的产物。所有的这些风味缺陷如酸败味、
8、奶酪味、苦味、酵母味和鱼腥味等产生的原因都被研究过。嗜冷菌分泌的蛋白酶和脂酶作用于牛乳中的蛋白质和脂肪而使其分解和被嗜冷菌吸收利用。嗜冷菌所分泌的热稳定的胞外酶在牛乳中含量很低时也能水解牛乳中的蛋白质和脂肪从而引起超高温牛乳产生苦味和出现胶凝沉淀；也能引起乳制品产生臭味。4.1对消毒乳质量的影响-酪蛋白被蛋白酶降解的速度要快的多。其中 -酪蛋白被降解，形成大量的苦味肽，是苦味形成的原因。当嗜冷菌在牛乳中的数量大于 5106cfu/ml107cfu/ml 时，虽然还没有引起蛋白质水解形成苦味肽，但是应该要求对这样的牛乳进行跟踪检测。蛋白酶是导致牛乳胶凝沉淀、产生苦味的原因。蛋白酶对 -酪蛋白的降
9、解将会导致酪蛋白胶束聚集和牛乳凝胶沉淀；-酪蛋白比4.2对干酪生产的影响含有大量嗜冷细菌的原料乳在低温下长时期贮藏会使干酪的产量下降。嗜冷菌引起干酪缺陷的主要表现是软而粘稠的组织结构、表面出现斑点、产生腐烂及腐败气味等。假单胞菌是干酪缺陷的形成的主要原因，但是干酪污染这些菌群如产碱杆菌属、肠杆菌属（Enterobacter ） 、黄色杆菌属、无色杆菌属、埃希氏杆菌属时也能引起干酪出现质量缺陷。4.3对酸奶质量的影响把含有大量嗜冷菌的原料乳用于制作酸奶时，产品会具有一种感官上不可接受的风味。COUSIN 和 MARTH 用接种了嗜冷菌并在 4.4的温度条件下培养了 35d 的脱脂乳为原料制作酸奶
10、，结果发现所得产品质量很差。用预先培养过黄杆菌或假单胞菌等菌株的牛乳为原料制作酸奶也发现所得产品质量差，会使产品具有一种感官上不可接受的风味。控制措施5.1加强卫生管理嗜冷菌的污染源是水和土壤，而水和土壤则有可能污染奶牛乳头和乳房表面；嗜冷菌也可能来源于有关器具和设备。这些污染都是可以避免的，通过采用合理措施清洗奶牛的乳头和乳房表面、牛场所用的挤奶设备、运输容器和管道以及加工厂所用的贮藏罐等设备，会使牛乳被污染的概率降低到最小。5.2预巴氏工艺处理预巴氏工艺是所采用的热处理强度小于巴氏灭菌的工艺。此种工艺采用的热处理强度是：对原料乳采用的热处理条件为 74/10s，然后冷却到 4.4。这个加工
11、工艺的目的是在新鲜牛乳中的嗜冷菌还没有充分生长繁殖、分泌胞外蛋白酶和脂酶之前将其灭活。GILMOUR的研究报道就表明预巴氏工艺可以明显降低牛乳中的嗜温菌和嗜冷菌的数量。预巴氏灭菌工艺并不影响原料乳的 pH 值，也不会使乳清蛋白质变性，在后续的巴氏灭菌工艺处理制作干酪时不会使其凝乳时间延长；预巴氏灭菌工艺还可以使蜡样芽孢杆菌等芽孢菌的芽孢被激活开始萌发，这就特别有利于在后续的巴氏灭菌工艺处理中使其灭活；同时预巴氏灭菌工艺处理还可以消除乳制品具有苦味的缺陷。ZALL 和 CHEN 的研究报道表明，对原料乳采用预巴氏工艺 74/10s 的热处理可使原料乳在冷藏条件下贮藏 8d 后，所制作的产品在感官
12、品质方面仍可以接受。未经过预巴氏工艺处理的，但在相同条件下贮藏的原料乳却只能存放两天。5.3添加乳过氧化氢酶体系另一种控制嗜冷菌的措施是凭借乳中过氧化氢酶体系。在原料乳中天然存在这样一种拮抗微生物的体系，它由乳过氧化氢酶、SCN-和 H2O2 三个部分组成。为了确保乳过氧化氢酶体系的活性，要求 SCN-和 H2O2 的比率为 1：1，但是牛乳中天然存在的比例和浓度不能使该体系发挥最佳功效，故可以向牛乳中添加 SCN-和 H2O2。H2O2 的添加方式是向原料乳添加具有产生 H2O2 活力的乳杆菌；也可以直接添加 H2O2 于牛乳中。乳过氧化氢酶体系在 pH 6.6 的冷藏牛乳中可发挥功效。在
13、60/15min 的热处理便可以失活。实践表明这个体系在巴氏灭菌之前对牛乳的冷藏保鲜作用非常明显。在冷藏贮藏 5d 期间内，嗜冷菌的生长被抑制，这种处理措施对牛乳的理化特性和营养价值也没有任何负面影响。在一项研究中，新鲜牛乳被冷却到 4，通过添加 0.25mM 的 SCN-和 H2O2 来使牛乳中的乳过氧化氢酶体系呈现活性。热处理牛乳和未经过热处理但添加乳过氧化氢酶体系的牛乳嗜冷菌的数量相比较，后者的数量仅比前者多 10 倍。5.4其它控制措施在冷藏的原料乳中添加 CO2 和充入 N2 均发现具有抑制嗜冷菌生长繁殖的功效。研究表明在原料乳中充入 N2 后贮藏于 4的条件下，嗜冷菌和乳酸菌在此条
14、件下与在 4有氧环境下相比较延迟期明显延长了，他们的生长速率变慢了，在对照样品中有大量的 -酪蛋白被水解，而充入氮气贮藏于 4的条件下的牛乳在贮藏 18d 后也没发现有这种变化。CO2 曾经被使用于抑制假单胞菌和其他嗜冷菌的生长繁殖从而延长牛奶的贮藏期，可使质量较差的牛奶在 4的条件下的贮藏 3 天、7的条件下的贮藏 2d；若是质量较好的牛奶贮藏期会更长4 。添加 2030mM/ml 的 CO2 也可降低大肠菌群数量和兼性或专性好氧的微生物菌群的数量。在很大程度上，CO2 抑制嗜冷菌分泌蛋白酶和脂酶的效果要优于抑制嗜冷菌的生长繁殖以及控制最终细菌数的效果。同时牛乳贮藏温度的下降也将有助于 CO
15、2 的功效的增加。添加 CO2 会使牛乳产生酸味，因此经过 CO2 处理的牛奶不适合用作制作液态奶销售，但是可以用于深加工制作乳制品。另外，Jaspe 发现添加 6mM 或 10mM 乳酸可使蛋白酶活性减少 50%；添加 9mM 的葡萄糖可使嗜冷菌蛋白酶的表达滞后 24h。于是推论认为乳中某些成分可以从转录水平上阻滞嗜冷菌蛋白酶的表达，且已被证实。6结论嗜冷菌污染是现代乳制品加工过程中最常见的问题，大多数嗜冷菌在 46贮存时，能产生耐热的酶类如蛋白酶、脂肪酶等，这些酶能耐受巴氏消毒甚至 UHT 处理，导致乳及乳制品风味、品质降低，缩短保质期，从而影响产品的质量及加工过程的顺利进行。原料乳中的蛋
16、白酶经过 55/h 的热处理后活性失去 96.8%，蛋白酶活性仅残余 3.2%，但将大量的生乳或成品在 55条件下长时间保温无论是设备或经济上都行不通。因此，搞好企业质量管理，防止生乳被嗜冷菌污染从而控制生乳中嗜冷菌的数量、控制其蛋白酶和脂酶的分泌；了解蛋白酶和脂酶的特性，从而有针对性的采取相应的措施。这对于提高乳制品品质，延长保质期，具有重要的意义。参考文献1 A.Jaspe and C.Sanjose，1999.Milchwissenscchaft 54(9):4932 E.P.Schokker and M.A.J.S. Van Boekel，1999.Milchwissenschaft.54:377，436. 3 KALOGRIDOU-VASSILIADOU，D.: Milchwissenschaft 39 601-603(1984)4 KING ， J.S，MABBITT ，L.A.: J.Dairy Res.49 43
