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1、1实验一 薄层色谱板的制备和使用目的要求：通过实验进一步理解薄层色谱技术理论，熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。一、薄层层析的基本原理把吸附剂（固定相）均匀地铺在一块玻璃板上，将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相）展开，由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同，当溶剂流过时，各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质被彼此分开，最后形成相互分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，应用特定的试药或方法将斑点显色，从
2、而达到定性和定量的目的。二、薄层板的制备1玻璃板用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎这些要求就可。如果找不到平整均一的，将旧光学照像底片截成同样大小也可以。用前先将玻璃用肥皂和水洗干净，必要时浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用纱布擦光。玻璃板大小有各种规格，一般有 2020、2010、205 厘米，也有更小的，可根据需要自行设计。宽度要求至少能点开两三个样品，每两点之间相隔至少 1.5 厘米，玻板长度一般要满足展开 10 厘米的距离。点样的起点应距底边至少 1.5 厘米的距离。2吸附剂应用最广泛的为硅胶和氧化铝，市场上有专供
3、薄层色谱用的吸附剂，规格分不含粘合剂的硅胶 H，氧化铝 H 和含有粘合剂熟石膏的硅胶 G，氧化铝 G，如市售硅胶 G 含 13熟石膏，氧化铝分中性、酸性、碱性三种。吸附剂的粒度范围最好在 180200 目之间，太小了流速慢，太大则影响分离效果。如不合要求，应过筛。3薄层板的涂布最简单的涂布方法是用两条比玻璃板厚 025 毫米的玻璃条或有机玻璃条（或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布） ，将玻璃板夹住，把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上，然后用一有机玻璃条或直尺，迅速均匀地向前推进，就象推血片一样，只要推进的速度均匀一2致，即可得到薄厚均匀的薄层板，如在一块玻璃板末端再接一块相同的玻璃板，把剩余的装液
4、接过去，可使涂层边缘整齐，厚度一致，吸附剂浆液的加水量和搅拌时间是涂布成败的关键，像 128 平方厘米的玻璃板需要 23 克硅胶 G，加 46 毫升水即可，只要技术熟练即能涂成厚薄一致，光滑平整的一块薄层板。不同性质不同批号的吸附剂，加水量和搅拌时间有时可有差异，应根据情况摸出规律。为了达到涂布的各板厚度均匀一致，最好采用涂布器进行薄层的涂布。为了增加薄层的牢固性及易于保存，可在涂布过程中加入某些粘合剂以增加薄层的硬度。一般采用添加剂羧甲基纤维素钠（CMCNa） ，应用方法是取 CMC-Na 1 克溶于 100毫升水中，加热煮沸溶解，按比例与硅胶搅匀，铺板。涂成之后先把玻板放在平面上，室内干固
5、，再对光检查，看是不是均匀，有无气泡，平整光洁度如何，合格的上烤箱 110加热 30 分钟进行活化，冷却后贮于干燥器内备用。在进行实验时，应尽量可能采用同批号涂布活化的薄层板，以减少因活化不一致引起的 Rf 值发生差异，目前国内市场已有成品供应，如黄岩化学分析材料厂即有各种类型的薄层板出售。三、薄层板的使用1点样将样品溶于适当的溶剂中（应尽量避免有水） ，取微量注射器或玻璃毛细管截齐后，吸取一定量的检样，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上，点的直径不要超过 0.3厘米，一次不能点完，待干后再点，稍有过分就会损伤板面，影响展开后的斑点形状。每两个样点之间相距至少 1.5 厘米。点样的起点距薄
6、板底边至少 1.5 厘米，以免样点浸入展开溶剂中，同块薄板上各样点应保持在与底边平行的一条直线上，为控制好点样距离，应用薄层点样尺架。2展开根据薄层板大小，自行选用适当玻璃标本缸，长方形，如 17106 厘米的标本缸可容纳下 159 厘米的玻璃板。采用较大的玻璃缸和玻璃板时，在缸内沿周围缸壁衬一层预先浸有溶剂的滤纸，以便缸内展开溶剂易达到饱和，防止边缘效应（即两边缘的点走得快）和同一物质 Rf 值不一致现象。一般将薄层板斜置展开容器内，密闭。先不使溶剂浸湿薄层板，饱和 1015 分钟后再进行展开，展开溶剂沿着薄层板向上移动。对加粘合剂的涂板可以近于垂直的状态进行展3开，而对未加粘合剂的薄层板则
7、必须以倾斜状态（15 度角）进行展开。为了防止产生“边缘效应”和展开溶剂不饱和现象。还可采用夹心式展开容器，其方法是将薄层板的左右两侧各刮去 510 毫米，垫上条状玻璃或塑料，盖一块与薄层板同样大小的玻璃，用夹子将两边夹好，插入展开溶剂中进行展开，并能取得良好效果。3显色薄层展开后，凉干。如含粘合剂，即可直接喷显色剂，使之显色，有的还需经紫外线（254nm）照射后方能显色；对不含粘合剂的薄板，在喷显色剂时应尽量远离薄层板，否则会连吸附剂一起吹掉，应予以注意。四、检样的定性定量分析1比移值（Rf）的测定当样品的薄板一端被展开，经过毛细管作用流向另一端，样品是按一定的比例分配在固定相与流动相之间。
8、并沿着溶剂流动的方向移动，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，各组分的移动速度也不同，经一定距离后使各组分彼此分离。样品各组分移动的速率，亦即分离后在薄层板上的位置与溶剂展开前沿的距离的比值为比移植。2定性分析相同的物质 Rf 值应当是相同的，但因能影响 Rf 值的因素很多，要想得到与标准物质相同的 Rf 值，最好在鉴定时，将样品与标准物质点在同一张薄层板上一同展开，根据检样斑点的 Rf 值与标准样品的 Rf 值比较，即可确定二者是否相同，但要做到准确的定性，需要两种以上展开溶剂系统所得的 Rf 值比较判断。3定量分析（1）目测比较法用吸附剂（如硅胶 G）涂布成厚 0.250.5 毫米，大小
9、 2020 厘米的薄层板，110活化 30 分钟，室温冷却。用微量注射器（10 微升）在距板底 1.5 厘米处，将标准样品溶液按 1、3、5、7 微克自左向右点在起始线上，然后再吸取不同量的检材提取溶液（相同于 1、3、5 克检材的提取溶液）按次序点在同一板的右侧。选择比移值适中的展开剂（Rf 在 0.450.75 之间者）用夹心式展开法或连续薄层展开法。展开距离为 10 厘米，显色剂要求能使显色后的斑点明显清晰。这样得到的色斑比较集中，重现性好，便于比较。显色后，观察其色斑大小，深浅与已知不同浓度的标准样品系列色斑相比较，粗略4定出含量，然后算出检液总体中含量，根据所取检材量，求出百分含量。
10、（2）洗脱测定法在制备好的薄层板左端，先点一标准样品点，作为对照定位用，然后根据检材提取溶液的多少，在同一板的右端点成点状或线状。置玻璃缸中展开（如有连续薄层展开仪更好） ，展开后晾干，再用玻璃板遮住右侧检材部分，仅使对照定位点显色。显色后，根据斑点位置将未显色部分（相当于色斑所在部分）的吸附剂用刮刀刮下或用抽吸法收集起来。将收集的吸附剂置于小层析柱管中，用极性大的溶剂甲醇或乙醇进行洗脱，收集洗脱液并加以浓缩。用适当溶剂调整到一定体积，可用紫外分光光度计，在被检物最大吸收波长处进行测定。同时用薄层吸附剂洗脱液作空白吸收值测定。如有灵敏度高专属性好的比色反应，还可用比色计测定化合物的含量。上述洗
11、脱液亦可作为气相色谱仪、液相色谱仪分析前的处理液。（3）薄层色谱扫描仪测量法以洗脱法处理层析色斑，不仅操作麻烦，而且有些待测成分不能定量地洗脱下来。或者在洗脱过程中发生分解，影响测定结果的准确性，最好是采用双波长薄层色谱扫描仪直接定量检测，经电子积分器积分推算出检样中待测物质的含量。其测定方法包括为：斑点面积测量法；斑点光密度测量法；斑点荧光测量法。附：实验仪器1薄层涂布器 2微量注射器 3薄层点样尺架4薄层板展开缸 5吸引器 6喷瓶7烘烤箱5实验二 氢氰酸及氰化物的检测目的要求：了解氰化物中毒的条件和毒性反应，掌握氰化物的化学性质，检材的采取及处理方法和常见的鉴定方法。一、检材采取和毒物的分
12、离1检材采取：最好的检材为中毒者剩余的食物、饮料、呕吐物及尸体胃和胃内容物，其次为血液，肺、肝、脑等。吸入中毒的应采取血液为宜。检材应盛于密闭容器内，并尽量少留空间，尽快进行检验，不能及时检验者应将检材低温冰冻保存。2毒物分离：含氰化物中毒检材的分离采用水蒸气蒸馏法（1）分离原理：氰化物遇酸可形成易挥发的氢氰酸，氢氰酸具有较高的蒸气压，检材在酸性条件下当和水同时加热或通入热水蒸气时，能随水蒸汽在较低的温度沸腾蒸馏出来，在碱性环境下被冷却收集，达到分离的目的。（2）操作方法：取适当量检材（1050 克） ，剪碎或捣碎，放入 250 毫升圆底烧瓶中，加水 2 倍，再加 10的酒石酸酸化（PH5）
13、。取 1000 毫升烧瓶作为水蒸气发生瓶，倒入热水，投入数小块沸石，上插安全管（长度 60 厘米的玻璃管） 。按图所示：用连接管将两瓶相连，将检材瓶浸入水浴锅中接上冷凝管，收集液瓶中加入 5 毫升0.01N 氢氧化钠溶液使接收管直接通到受液瓶中稀碱液液面下，以防馏出氰化物逸失，检查所有瓶塞及各接头处紧密不漏气后，将水蒸气发生瓶和水浴锅同时加热，收集馏液 10 分钟备检。注意事项6（1）检材处理的愈碎愈好，检材溶液必须呈酸性。（2）蒸馏装置的各接头处必须严密不漏气。（3）蒸馏完毕后，应先将受液瓶取下，再将水蒸气发生瓶的瓶塞放松，或将水蒸气发生瓶与检材瓶之间的连接处拆开，然后再停止加热以防各瓶之间
14、相互倒流。（4）对血液、面糊、稀粥等检材，可加入 23 毫升液体石蜡或适量的三氯醋酸溶液，以避免蒸馏时发生大量的泡沫溢入冷凝管。（5）蒸馏瓶中的内容物，不能超过瓶容积的 1/3。二、氢氰酸及氰化物的鉴定方法（一）普鲁士蓝反应：1原理：蒸馏出来的氢氰酸吸收在稀碱溶液中生成氰化钾，加硫酸亚铁后生成亚铁氰化钾（黄血盐） ，后者与溶液内亚铁氧化成高铁，在酸性条件下，化合为亚铁氰化铁，即普鲁士兰或柏林蓝。该反应是氰化物的专属反应，阳性结果可确证氰化物的存在，反应灵敏度为 1：5000。2操作方法：取蒸馏液 35 毫升，加新配的 20硫酸亚铁 2 滴，加热至恰沸，加稀硫酸使成酸性，如有氰根视含量多少，溶液
15、有蓝绿色至深蓝色。量多即析出蓝色沉淀，量少时颜色和沉淀可能要隔 2448 小时后才显出。（二）氰化物的快速检验法检材不经水蒸气蒸馏，可直接做普鲁士兰试验。1原理：氢氰酸与硫酸亚铁氢氧化钠试纸作用生成亚铁氰化物，在酸性条件下，再与由空气氧化产生的三价铁离子作用生成普鲁士兰。6HCN+Fe2+6OH-= Fe（CN） 64-+6H2O4Fe3+3 Fe（CN） 4-6Fe 4Fe（CN） 63（普鲁士兰）2操作方法：取检材 510 克，置锥形瓶中，加适量水调成稀糊状，加 10的硫酸使之变成酸性，取滤纸一小方，滴加新配制的 20硫酸亚铁 2 滴及 10氢氧化钠 2 滴，将此滤纸覆盖于锥形瓶口，瓶底缓
16、缓加热，待有蒸气上冒，取下滤纸，浸入 6N 盐酸内，如有氰根，滤纸即蓝色斑点，水洗，色斑更鲜艳。7实验三 血中一氧化碳的检测目的要求：熟悉一氧化碳中毒的特征和检材的采取要点，掌握碳氧血红蛋白分析鉴定方法及饱和碳氧血红蛋白的制备技术。一、检材的采取一氧化碳中毒检材以取血液为最好，对于尸体通常是采取心腔内血液进行检测。活体通常静脉采血并要加抗凝剂，密封。盛装检血的容器应将检血装满不要留有空间，以避免一氧化碳损失而影响检验结果。二、碳氧血红蛋白的鉴别试验1煮沸法取血 23 毫升，置试管内，放水浴锅中加热，使发生凝固。如系一氧化碳血，呈砖红色凝固体，而正常血则呈褐色或黑褐色凝块。此法最简便，不需任何试剂，在勘验现场即可进行，但含量在 40才可测出。2硫化铵法取水 10 毫升，加血 5 滴，加硫化铵 5 滴，较混合之，再加少量 10醋酸使微呈酸性，如系
