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1、第四章 细胞毒性 T 细胞作用的分子机制免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病原体的体液免疫反应和以细胞毒性 T 细胞（CTL）为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括 NK 细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和 CTL 为主、Th 细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL 对于被感染细胞的 MHC I 类分子限制特异性的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分子设计都有重要意义。第一节 CTL 作用概述CTL 即杀伤
2、性 T 细胞，是一类具有 CD8+表面标志、受 MHC I 类分子限制性杀伤功能的 T 细胞。 CTL 的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL 介导的靶细胞杀伤的特点是：杀伤受 TCR 以及 MHC I 类分子的严格限制。CTL 对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和快速性的特点。另外，IL-2 和其它一些细胞因子在 CTL 前体的体外培养和效应 CTL 的分化诱导中也起着重要作用。一、CTL 的主要生物学功能CTL 对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL 在识别“改变”了的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。由于人体所有的有核细胞
3、都表达 I 类 MHC 分子，因此，CTL 原则上可以识别和清除几乎所有改变了的自身细胞。二、CTL 作用的 MHC 限制性CTL 的杀伤作用受 MHC 严格限制。 CTL 在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可溶性抗原或者与非自身 MHC I 类分子结合的抗原，而只能识别与自身 MHC I 类分子相联系的特异性抗原多肽。三、CTL 的组成CTL 的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这一功能来确定的。因此，CTL 不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的 T 细胞群体。在组成上，它包括 CD8+T 细胞和 CD4+T 细胞。1、CD8+ T 细胞 主要有
4、 TCR 型 CD8+T 细胞和TCR 型 CD8+T 细胞。前者以TCR 识别靶细胞表面上的 MHC I 类分子- 肽复合物（图 4- ） ；后者则以TCR 识别靶细胞表面的抗原肽抗原肽CD4+TCRTCRCD8+HLA-I HLA-II 图 4-1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物MHC I 类分子- 肽复合物。尽管TCR 型 T 细胞仅占 CTL 群体中的极小部分，但在对一些特殊抗原的免疫反应中，它们起着非常重要的作用。2、CD4 +T 细胞 CD4+T 细胞通常被认为是在抗原免疫过程中通过分泌细胞因子及表达表面分子介导细胞间相互作用，来调节和增进体液免疫和细胞免疫反应，主要起辅助作
5、用。但在某些情况下，CD4 +T 细胞也具有杀伤功能，且主要依赖 Fas-FasL 机制。实验证明当抗原由 II 类 MHC 分子而不是由 I 类 MHC 分子呈递时， CD4+T 细胞可以取代 CD8+T 细胞而发生反应，成为杀伤性的 CTL。四、CTL 作用的主要过程CTL 介导的靶细胞杀伤反应可分为 3 个阶段：识别启动、增殖分化及效应阶段。1、识别启动阶段在这一阶段，CTLp（CTL 前体）通过表面的 TCR 特异性地识别并结合靶细胞表面呈递的 I 类 MHC 分子-抗原多肽复合物，和其它若干对表面分子的配体（图 4-2） 。Fig 4-2 Accessory molecules of
6、 T lymphocytesThe interaction of a cdCD4+helper T cell with an APC (A),or of a CD8+CTL with a target cell (B), involves multiple T cell membrane proteins that recognize different ligands on the APC or target cell. 2、增殖分化阶段在此阶段，Th 细胞发生大量增殖并分泌 IL-2 等细胞因子； CTL 则在特异性增殖的同时，自前体细胞分化成为效应 CTL。（1）Th 细胞的增殖对 CT
7、Lp 分化的辅助作用 当 CTLp 识别了呈递于靶细胞表面与I 类 MHC 分子相结合的特异性抗原多肽后，特征性地表达 IL-2R（受体） 。由于此时 Th 细胞也受到特异性抗原的刺激，产生大量的 IL-2。这些 IL-2 与激活的 CTLp 表面的 IL-2R 结合，使得 CTLp 发生特异性的增殖，逐步分化成为成熟的效应 CTL。（2）巨噬细胞对 CTLp 分化的辅助作用 研究证明巨噬细胞的作用是用以激活 II类 MHC 限制性的 Th 细胞。（3）细胞因子对 CTL 的产生调节 多种细胞因子，包括 IL-2、IL-4 、IL-7、IL-10、IL-12 和 IL-15，其中 IL-2 诱
8、导 CTL 杀伤活性的能力较强。这些细胞因子通过诱导相关基因的表达，使 CTLp 朝着成熟方向分化，并使抗原特异性 CTL 克隆的生长和增殖加快。3、效应阶段在效应阶段，已分化成熟的效应 CTL 发挥其杀伤功能，特异性裂解靶细胞。作用的过程可分为 4 个阶段：识别与结合、细胞器重排与颗粒外吐、CTL 解离、靶细胞解体（图4-3,4-4） 。CTL 再循环颗粒CTLCD8 TCR偶合物 CTL 细胞 CTL 颗粒MHC I-肽 形成 器重排 外吐膜损伤靶细胞图 4-3 CTL 介导的靶细胞杀伤过程（1）识别与结合 CTL 表面的 TCR 识别并结合靶细胞表面的 I 类 MHC-多肽复合体，同时还
9、需其它若干对表面分子参与，才能加强和稳定 CTL 与靶细胞的结合。其中，CTL 上的 CD11a/CD18 （LFA-1）与靶细胞上的 ICAM-1 或 ICAM-2 可能是最重要的一对结合分子。Target cellB form pores in the target cell membrane C. Target cell apoptosis A Conjugate formation between CTL and Target cellFig 4-4 Killing of Target cells by CTLCTLs from a cloned cell line specific
10、for the human MHC molecule bind to MHC-expressing target cell (A), result in the membrane pored (B) and induce target cell apoptosis (C). （2）细胞器重排与颗粒外吐 CTL 上的 TCR 是与细胞内一些细胞骨架成分如小管和肌动蛋白偶联的。当 TCR 与靶细胞上的 MHC I-多肽复合体交联后，将通过这些细胞骨架成分启动细胞器的重排。高电子密度的颗粒明显地向靶细胞方向移动，并在结合部位直接外吐颗粒内含物质，对靶细胞膜进行攻击。这一胞质颗粒的外吐是由 Ca2+流
11、入 CTL 所诱发的。（3）CTL 解离 CTL 向靶细胞释放颗粒内含物后，即完成其杀伤过程，开始与靶细胞解离。离开靶细胞后，又可重复以上过程，重新结合靶细胞，重复杀伤。因此 CTL 可以杀伤多个靶细胞，即 CTL 可循环利用。（4）靶细胞解体 CTL 离开靶细胞后，靶细胞开始出现核膜与细胞膜的破裂，直至细胞裂解死亡（图 4-5） 。第二节 CTL 分子机制及应用前景一、CTL 作用的分子模式CTL 杀伤靶细胞的分子机制包括胞质颗粒依赖机制和 FasL-Fas 介导的凋亡机制（图4） 。 1、胞质颗粒依赖机制Target cellGranzyme, perforinProcess and pr
12、esentation of antigen by target cellTCR/antigenic peptide: MHC I complexCTL activated kills the target cell (granzyme/ perforin, FasL/Fas)CTL dissociation and target cell apoptosisFig 4-5 The stage of CTL killing the target cellCTL 可以通过外吐胞质颗粒，释放颗粒内含物，导致靶细胞的损伤。CTL 胞内含许多颗粒，直径 0.51m，主要有两种成分：颗粒核心核多囊泡结构。
13、颗粒核心中包含穿孔素、颗粒酶和粘蛋白，而多囊泡结构则包含溶酶体酶和溶酶体的一些膜标志。穿孔素是胞质颗粒中参与靶细胞损伤过程的最主要蛋白，穿孔素似乎唯一地表达于 CTL 颗粒中。它可在靶细胞膜上聚合，形成穿膜孔道，以穿孔方式裂解靶细胞。（1）穿孔素的穿孔机制 穿孔素是一个含 555 个氨基酸的糖蛋白，分为两个重要的功能区：补体同源区和 C2 区。穿孔素以单体存在，插入靶细胞膜中，发生聚合，产生多种不同聚合数目的多聚体。CTL 通过可咯外吐方式释放出穿孔素，进入细胞间隙。穿孔素在 Ca+存在下，引起构象变化，暴露其疏水基团，附着并插入脂质双层膜中，在靶细胞膜表面形成多个孔洞，最终引起靶细胞解体（图
14、 4-6） 。靶细胞CTL 穿孔素颗粒酶颗粒外吐FasL FasFasL FasL 蛋白 凋亡信号图 4-6 CTL 杀伤的胞质颗粒酶依赖和 Fas/FasL 凋亡机制（2）胞质颗粒内其它酶或分子依赖的非穿孔素机制 A 丝氨酸脂酶/颗粒酶；B 粘蛋白； TNF。2、非胞质颗粒依赖机制FasL/Fas 机制CTL 对靶细胞的杀伤主要引起靶细胞的膜结构破裂以及核 DNA 的快速降解，但胞质颗粒依赖机制只能引起靶细胞的膜结构破裂，而不能导致靶细胞核 DNA 的降解，目前认为 Fasl/Fas 介导的细胞凋亡是 CTL 杀伤靶细胞的非胞质颗粒依赖机制。Fas/Apo-1 即 CD95 分子，编码分子量
15、 45103 单位？的跨膜蛋白，是 TNF 受体相关蛋白（TNFR）的一种。Fas 蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其中胞内区含一个与细胞凋亡相关的死亡区域。Fas 主要以膜受体形式存在，广泛表达于外周活化 T、B 细胞，NK细胞，单核细胞，成纤维细胞等。FasL 是分子量为 30103 单位？的 TNF 相关 II 型膜蛋白，也由细胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区与 TNF 家族成员高度同源。FasL 除了在淋巴细胞表达外，还在其他一些细胞表达，包括巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、神经元细胞和若干肿瘤细胞。因靶细胞上的 Fas 与 CTL 等具有杀伤功能的细胞上的 FasL 结合是诱导
16、靶细胞产生凋亡的主要途径之一，因此 Fas 可称死亡分子，FasL 则称死亡因子。FasL-Fas 作用的分子机制 FasL-Fas 机制介导的杀伤过程可分为两个时期：激活启动期和 FasL-Fas 结合期。FasL-Fas 机制的启动仍然必需 CTL 上的 TCR 对靶细胞 MHC I-肽复合物的识别，同样需要 CTL 与靶细胞发生 Mg+依赖的结合和粘连。激活期依赖于细胞外Ca+/Mg+环境的存在以及细胞内 RNA 合成与蛋白合成所需的酶与基质。TCR 对靶细胞MHC I-肽复合体的识别与结合同时启动了 CTL 染色体 DNA 上 FasL 基因以及靶细胞染色体 DNA 上 Fas 基因的转录和翻译，随后，FasL 表达在 CTL
