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1、细胞调亡的几种检测方法一、形态学观察方法(一)、HE 染色、光镜观察:凋亡细胞呈圆形,胞核深染,胞质浓缩,染色质成团块状,细胞表面有“出芽”现象。(二)、丫啶橙(AO)染色,荧光显微镜观察:活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。(三)、台盼蓝染色:如果细胞膜不完整、破裂,台盼蓝染料进入细胞,细胞变蓝,即为坏死。如果细胞膜完整,细胞不为台盼蓝染色,则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性,区别坏死细胞有一定的帮助。(四)、透射电镜观察:可见凋亡细胞表面微绒毛消失,核染色质固缩、边集,常呈新月形,核膜皱褶,胞质紧实,
2、细胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。二、DNA 凝胶电泳(一)、检测原理细胞发生凋亡或坏死,其细胞 DNA 均发生断裂,细胞内小分子量 DNA 片断增加,高分子 DNA 减少,胞质内出现 DNA 片断。但凋亡细胞 DNA 断裂点均有规律的发生在核小体之间,出现 180200bpDNA 片断,而坏死细胞的 DNA断裂点为无特征的杂乱片断,利用此特征可以确定群体细胞的死亡,并可与坏死细胞区别。(二)结果判断正常活细胞 DNA 电泳出现阶梯状(LADDER)条带;坏死细胞 DNA 电泳类似血抹片时的连续性条带。三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定凋亡细胞的
3、 DNA 断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的 DNA 片断组成,可由 ELISA 法检测。(一)检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心,其上清液中含有核小体;2、在微定量板上吸附组蛋白体3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合4、加辣过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体使之与核小体上的 DNA 结合5、加酶的底物,测光吸收制。(二)用途该法敏感性高,可检测 5*100/ml 个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器,适合基层工作,但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流式细胞仪定量分析(一)检测原理细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性也增加,但是其程度
4、介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。(二)应用价值流式细胞仪检测具有以下特点:1、检测的细胞数量大,因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2、可以做许多相关性分析3、结合被检测细胞的 DNA 含量的分析,可确定凋亡的细胞所处的细胞周期检测形态学及细胞膜完整性的 Hoechs-PI 双染色法细胞发生凋亡时,其细胞膜的通透性液增加,但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间,利用这一特点,被检测细胞悬液用荧光素染色,利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用 H
5、oechs-PI 染色法,正常细胞对染料有抗拒性,荧光染色很浅,凋亡细胞主要摄取 Hoecha 染料,呈现强蓝色荧光,而坏死细胞主要摄取碘化丙啶(PI)而呈强的红色荧光。DNA 片断原位标记法凋亡细胞 DNA 片断原位末端检测技术是指在细胞(或组织)结构保持不变的情况下,用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸(deoxyuridinetriphate,DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)相反应与凋亡细胞裂解后 3的羟基(OH)端结合,经显色反应后检测 DNA 裂解点的技术。DNA 片段原位标记法有二种:1、原位缺口转移( in situ nick-translation,ISNT)技
6、术,它是利用 DNA 多聚酶 I 将标记的核苷酸连接到断裂 DNA 的 3OH 端2、原位缺口末端标记技术(in situ end labelling technique,ISEL),即 TUNEL 法,它是利用 TdT 将标记的 DUPT 接到 3-OH 端。研究证明,TUNEL法的敏感性远高于 ISNT,尤其对早期凋亡的检测, TUNEL 更为合适。 检测细胞膜成分变化的 Annexin V 联合 PI 法1、原理:在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白 V(Annexin V)是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白,它于 PS 具有高度的结合力。因此,An
7、nexin V 可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对 PS 有高度亲和力的 Annexin V,将 Annexin V 标记上荧光素(如异硫氰酸荧光素 FITC),同时结合使用 PI 拒染法(因坏死细胞 PS 亦暴露于细胞膜外测,且对 PI 高染)进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断:正常活细胞 Annexin V 、PI 均低染;凋亡细胞 Annexin V 高染、PI 低染;坏死细胞 Annexin V/PI 均高染。3、应用价值:细胞发生凋亡时,膜上的 PS 外露早于 DNA 断裂发生,因此 Annexin V 联合 PI 染色法检测早期细胞凋亡较 TUNEL 法更为灵敏。又 Annexin V 联合 PI 染色不需固定细胞,可避免 PI 染色因固定造成的细胞碎片过多及 TUNEL 法因固定出现的 DNA 片段丢失。因此,Annexin V 联合 PI 法更加省时,结果更为可靠,是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。