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1、拟南芥基因的图位克隆技术浙江大学生命科学学院 徐冰浙江杭州 3100291 国内外研究现状拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。从遗
2、传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行；反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现。虽然一些模式生物（如拟南芥）的基因组测序已经完成，但还有 40%的基因（在拟南芥中）的功能还是未知的。图 1 图位克隆所需努力的比较（1995 年和 2002 年）（Jander 等， 2002）图位克隆（map-based cloning）又称定位克隆（positional cloning），1986 年首先由剑桥大学的 Alan Coulson 提出（ Coulson 等，1986），用该方法分离基因是根据
3、目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的 DNA 序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。近几年来随着拟南芥基因组测序工作的完成，各种分子标记的日趋丰富和各种数据库的完善，在拟南芥中克隆一个基因所需要的努力已经大大减少了（图 1）。目前完成整个拟南芥的图位克隆过程大约需要一年时间。在这个过程中，我们从筛选突变体开始，逐渐找到和表型相关的基因。这和反向遗传学的方法正好相反。图位克隆能实现，关键在于全基因组测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中（表 1）（Lukowitz 等， 2000）
4、。在拟南芥中的图位克隆，在很大程度上得益于对 Col-0 生态型测序的完成，因为它是在研究拟南芥时最常用的生态型。实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。实质上，分子标记是一个特异的 DNA 片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选（Wang 等，2000）。其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLPs）（Lukowitz 等， 2000； Choe 等， 2002； Gonzalez-Guzman 等， 2002）和单核苷酸多态性（SNPs）（Rafalski， 2002）。SSLP 是基于 PCR 的分
5、子标记，在拟南芥基因组中有较多分布，而且是共显性的，它的检测非常直接，但是我们需要设计引物来检测假定的 SSLP 标记；对 SNPs 标记的检测也比较直接，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于不编码区域（Peters 等， 2003）。最常见的用于检测 SNPs 标记的方法主要是剪切扩增多态性序列（CAPS），它也是基于 PCR 的。另外，一种更为有效的方法衍生的CAPS（dCAPS）（Nam 等， 1989； Michaels 和 Amasino， 1998）可把任何已知的点突变作为分子标记，只要在 PCR 是引入不配对的引物，使扩增的序列在一个生态型
6、中具有限制性酶切位点，而在另一生态型中没有，以形成多态性。图位克隆法随着相关配套技术（序列数据库、分子标记等）的日渐成熟，许多拟南芥及一些农作物的基因已被成功的克隆（表 2）。本文拟对图位克隆的研究进展做一介绍，以期对植物遗传育种和分子生物学研究有所帮助表 1 拟南芥网络资源网站 网址Supplemental material for this paper http:/carnegiedpb.stanford.edu/methods/ppsuppl.htmlNottingham Stock Centre（U.K.） http:/nasc.nott.ac.uk/Recombinant Inbre
7、d map http:/nasc.nott.ac.uk/new_ri_map.htmlOhio Stock Center（U.S.A. ） http:/aims.cps.msu.edu/aims/TAIR database*， homepage http:/www.arabidopsis.orgRecombinant Inbred map（mirror site） http:/www.arabidopsis.org/cgi-bin/maps/RiintromapCAPS markers http:/www.arabidopsis.org/aboutcaps.htmlSequence table
8、 http:/www.arabidopsis.org/cgi-bin/maps/Seqtable.plSNP collection http:/www.arabidopsis.org/SNPs.htmlCEREON collection of polymorphisms http:/www.arabidopsis.org/cereonSSLP markers http:/genome.bio.upenn.edu/SSLP_info/SSLP.htmlTIGR， genome annotations http:/www.tigr.org/tdb/athl/htmls/index.htmlData
9、base of Ler sequences http:/www.tigr.org/tdb/atgenome/Ler.htmlKasuza DNA Research Institute， genome annotations http:/www.kazusa.or.jp/kaos/MIPS genome annotations http:/websvr.mips.biochem.mpg.de/proj/thal/SINS database of transposon insertions http:/www.jic.bbsrc.ac.uk/sainsbury-lab/jonathan-jones
10、/jjhome.htm*注：The Arabidopsis Information Resource （TAIR）2 图位克隆的一般过程因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直接。图 2 例举了一种高效的拟南芥图位克隆方法。从基于 Col-0 和 Ler 遗传背景的突变体出发，我们有可能在大约一年时间内找出与这个突变相关的基因，这其中主要耗时间的是五个植物（拟南芥）的生长周期（我们假定每个周期为两个月）。作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0 或者 Ler）的植株杂交。在大多数情况下，用于杂交的突变体植株是作为父本还是母本是没有关系的。然后
11、播种 F1代种子。在 F1 代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。F1代植物的表型的出现或者消失将显示着我们所研究的突变是显性的还是隐性的。最好通过对一些标记的分析来确认 F1 代植物是杂合体，而且在杂交过程中我们没有犯错误。当然也有必要确认原来的生态型背景。表 2 用图位克隆方法得到的拟南芥及一些农作物的基因基因 突变表型 基因同源序列AB13 脱落酸不敏感 玉米转录子FID3 降低亚油酸饱和度 细菌去饱和酸酶AXR1 生长素抗性 泛素 N 端活性酶ETR1 乙烯抗性 双因子调节子ABI1 脱落酸不敏感 钙调蛋白磷酸化酶DET1 黄化损伤反应 新核蛋白RPS2 抗病
12、新型富含亮氨酸的蛋白酶RPM1 抗病 激酶RSW1 纤维素合成酶 细胞色素 P450 家系ZLL 调节中茎分生 细胞胚胎发育蛋白PRT1 抑制胞间蛋白降解 控制植物 N 端代谢Tornadol 植株短化 IFL1 正常的维管束间纤维分化受阻 亮氨酸拉链蛋白ARA1 树胶醛糖激酶活性丧失 半乳糖激酶基因家族VTC2 维生素 C 合成不足果蝇蛋白 CG3552，线虫蛋白 C10F3.4（功能未知）AST 种皮花青苷斑点花青苷生物合成途径中的二氢黄酮醇-4-还原酶图 2 图位克隆过程示意图（Jander 等， 2002）F1 代植物自交得到 F2 代种子，大约播种 600 个个体以进行突变基因的粗定
13、位（first-pass mapping，图 2）。在其生长过程中，我们可确定其表型，大约有 150 个个体被认为是纯合体（在隐性突变的情况下是纯合突变体，在显性突变的情况下是纯合野生型）。然后从这150 个个体的叶子或者其它组织中制备 DNA 用于基因型分析。起先用分布于拟南芥五条染色体上的 25 个标记（相邻的两个标记之间大约相距 20 cM）进行分析，确定突变基因是和哪个或者哪几个标记是连锁的，然后用三点测交的方法来定义一个包含突变基因的大约 20 cM 的遗传间隔。一旦这样的一个遗传间隔被定义之后，接下来的工作就是引入新的标记把这个间隔缩小到大约 4 cM。一般来说，利用 150 个
14、F2 代个体是在很大程度上能找到这样一个遗传间隔的，距离突变基因最近的两个分子标记将作为侧面标记而用于下面的进一步分析。下一步我们将播种一个更大的 F2 代群体用于突变基因的精细定位（fine-resolution mapping，图 2）。最终目标是将包含突变基因的遗传间隔缩小到 40 Kb 甚至更小（这在拟南芥中大约是 0.16 cM）。显然用于作图的 F2 代植物越多，就越能精确地定位突变基因。一般需要 30004000 个 F2 代植物个体（包括粗定位时的 600 个 F2 代植物个体）来精确地定位突变基因。但是也有很多图位克隆过程用了少于 3000 个 F2 代植物个体就成功地定位了
15、突变基因（Lukowitz 等， 2000）。但是这往往要冒因为作图群体不够大再一次种植 F2代植物而延长整个作图过程的时间的风险。在这个大约 4 cM 的遗传间隔内找到与突变更紧密连锁的分子标记，一般情况下能在突变两侧找到相距小于 40 Kb 的两个分子标记。一旦这样的两个分子标记被找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。一种有效的方法是设计 PCR 引物来扩增覆盖这 40 Kb 的多个重叠的 500 bp 的片段。将这些片段测序后拼接起来以得到整个 40 Kb 的序列，然后将它与野生型植物（Col-0 或者 Ler）的序列进行比对，这就可以找到这个区域中的多个基因。从一系列侯选基因中鉴定基
16、因是定位克隆技术的最后一个关键环节。现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如 BAC 克隆或 YAC 克隆去筛选 cDNA 文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精确定位法检查 cDNA 是否与目标基因共分离；（2）检查 cDNA 时空表达特点是否与表型一致；（3）测定 cDNA 序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA 序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。功能互补实验是最直接、最终鉴定基因的方法。利用新兴的 RNA 干扰（RNAi）也可有效地确定目的基因。3 存在的问题图位克隆也有其自身的局限性，在某些情况下，就很难或者不能通过图位克隆技术来定位基因。在分析自然发生的变异的时候，我们最有可能遇到的复杂情况是一个给定的性状是由不止一个的基因位点控制的。例如，在 Kashmir-1（有抗性的）和 Columbia（敏感的）株系之间
