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1、第一部分:基因组 DNA 的提取及常见的问题第二部分: RNA 的提取及常见的问题基因组 DNA 的用途DNA 是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象.为了进行测序,杂交和基因的表达,获得高分子量和高纯度的基因组 DNA 是非常重要的前提.基因组 DNA 提取的原则保证提取的 DNA 具有一定的长度纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质排除有机溶剂和金属离子的污染蛋白质,多糖,脂类等降低到最低程度排除其他核酸分子的污染基因组 DNA- CTAB 法CTAB 法原理(植物 DNA 提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromid
2、e,十六烷基三甲基溴化铵 ),是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物,只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提,去除蛋白,多糖,酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.注:CTAB 溶液在低于 15 时会形成沉淀析出 ,因此在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于 15.基因组 DNA- CTAB 法CTAB 提取缓冲液的经典配方Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境 ,防止核酸被破坏;EDTA 螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制 DNase 活性
3、;NaCl 提供一个高盐环境,使 DNP 充分溶解,存在于液相中;CTAB 溶解细胞膜,并结合核酸 ,使核酸便于分离;-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌 ,避免褐变,使酚容易去除基因组 DNA- CTAB 法CTAB 提取缓冲液的改进配方PVP(聚乙烯吡咯烷酮) 是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质 ,有效去除多酚,减少DNA 中酚的污染;同时它也能和多糖结合 ,有效去除多糖.基因组 DNA-其它方法物理方式:玻璃珠法,超声波法 ,研磨法,冻融法化学方式:异硫氰酸胍法,碱裂解法生物方式:酶法根据细胞裂解方式的不同有:基因组 DNA-其它方法吸附材料结合法:根据核酸分离纯化方式的
4、不同有:硅质材料阴离子交换树脂磁珠高盐低 pH 值结合核酸,低盐高 pH 值洗脱.快捷高效.低盐高 pH 值结合核酸,高盐低 pH 值洗脱.适用于纯度要求高的实验.磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物,从而达到分离目的.基因组 DNA-其它方法浓盐法:有机溶剂抽提法:密度梯度离心法:利用 RNP 和 DNP 在盐溶液中溶解度不同,将二者分离有机溶剂作为蛋白变性剂,同时抑制核酸酶的降解作用利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物DNA 提取的基本步骤I.材料准备II.破碎细胞或包膜-内容物释放III.核酸分离 ,纯化IV.沉淀或吸附核酸,并去除杂质_V.核酸溶解在适量缓冲液或水中材料准备和裂
5、解最好使用新鲜材料,植物组织应尽量选取不含油脂,蜡质和真菌感染的部位,保证材料基因组的单一.低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组 DNA 时,要选择有核细胞(白细胞);组培细胞培养时间不能过长,否则会造成DNA 降解;含病毒的液体材料 DNA 含量较少,提取前先富集基因组 DNA 的提取细胞裂解材料应适量,过多会影响裂解,导致 DNA 量少,纯度低针对不同材料,选择适当的裂解预处理方式:植物材料-液氮研磨,干种子可以在室温研磨或用粉碎动物组织-匀浆或液氮研磨组培细胞-无需预处理细菌- 溶菌酶破壁酵母-破壁酶或玻璃珠需要用蛋白酶 K 高温温浴时 ,定时轻柔振荡基因组 DNA 的提取核酸分
6、离,纯化采用吸附材料吸附的方式分离 DNA 时,应提供相应的缓冲体系采用有机(酚/氯仿)抽提时应充分混匀 ,但动作要轻柔离心分离两相时,应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点,在提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组 DNA 的提取核酸分离,纯化蛋白质的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS,异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离,纯化多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5M NaCl,高盐可溶解多糖.用多糖水解酶将多糖降解.在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2 体积),氯苯可以与多糖的羟基作用,从而去除多糖 .用 PEG8000 代替乙醇沉淀 DNA:
7、在 500 L DNA 液中加入 200l 20% PEG8000 (含 1.2 M NaCl) ,冰浴 20min.核酸分离,纯化多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂:-巯基乙醇,抗坏血酸 ,半胱氨酸,二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如 PVP(聚乙烯吡咯酮),PEG( 聚乙二醇),它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与 DNA 的结合盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附,沉淀和溶解使用合适的吸附材料吸附核酸,其它的杂质均被洗掉,达到纯化 DNA 的目的另一种方式加入 1/10 体积的 NaAc(pH5.2,3M),用预冷的乙醇或异丙醇沉淀 RNA吸附或沉淀后应用 70%的乙醇
8、洗涤 ,以除去盐离子等若长期储存建议使用 TE 缓冲液溶解TE 中的 EDTA 能螯合 Mg2+或 Mn2+离子,抑制 DNasepH 值为 8.0,可防止 DNA 发生酸解基因组 DNA 的提取基因组 DNA 的检测提取的基因组 DNA 片段在 20kb-30kb 之间高质量的基因组 DNA带型 单一无拖尾现象DNA 浓度及纯度的检测(A260=1 约 50 g/ mL 双链 DNA; A260/280 约为 1.8 )基因组 DNA 提取常见问题DNA 中含有蛋白,多糖,多酚类杂质DNA 在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应DNA 中残留有金属离子有 RNA 的存留原因对策重新纯化
9、DNA,过吸附柱去除蛋白,多糖,多酚等杂质重新沉淀 DNA,让酒精充分挥发增加 70%乙醇洗涤的次数(2-3 次)加入 RNase 降解 RNA问题一:DNA 样品不纯,抑制后续酶解和 PCR 反应.DNA 提取常见问题材料不新鲜或反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈,DNA 被机械打断外源核酸酶污染反复冻融原因对策尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的材料的 DNA 时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌将 DNA 分装保存于缓冲液中,避免反
10、复冻融问题二:DNA 降解.DNA 提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附或沉淀不完全洗涤时 DNA 丢失原因对策尽量选用新鲜(幼嫩)的材料动植物要匀浆研磨充分;G+菌,酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁.高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞,细菌可增加 PK 的用量).增加吸附的时间,或低温沉淀小心操作问题三:DNA 提取量少.内 容第一部分:基因组 DNA 的提取及常见的问题第二部分:RNA 的提取及常见的问题分离提纯 RNA 的目的分析不同发育时期基因的表达状况获得新基因研究基因的拼接分析相应的蛋白产物RNA 的不稳定性由于核糖残基的 2和 3位置带有羟基,RNA 易于被
11、RNA 酶切割水解RNA 酶含量丰富,加热后仍能够正确折叠恢复活性,不易失活提取 RNA 的注意事项预防 RNase 污染,应注意以下几方面:经常更换新手套.因为皮肤和实验室用品上可能有 RNase,会导致 RNase 污染.使用灭过菌的塑料制品和枪头避免交叉污染.应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿.玻璃器皿可在 150 烘烤 4 小时,塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟,然后用水彻底清洗,再灭菌,即可去除 RNase.常用 RNA 酶抑制剂焦磷酸二乙酯(DEPC): 与 RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,强烈但不彻底的 RNA 酶抑制剂 .异硫氰酸胍
12、:目前是最有效的 RNA 酶抑制剂,裂解组织的同时也使 RNA 酶失活.既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对 RNA 酶有强烈的变性作用.氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物 ,它和 RNA 酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制 RNA 酶的活性.RNA 酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白 .RNasin 是 RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种 RNA 酶结合,使其失活.其它:SDS,尿素,硅藻土等对 RNA 酶也有一定抑制作用.RNA 提取的步骤材料的裂解杂质的去除RNA 的吸附或沉淀异硫氰酸胍,亚硫氢胍,巯基乙醇,N-月桂
13、肌氨酸 等.使细胞及核蛋白复合物变性 ,释放 RNA,有效抑制核酸酶.苯酚,氯仿,异戊醇抽提去除杂物,使 DNA 及蛋白沉淀到有机相.硅质材料的吸附或用异丙醇沉淀浓缩 RNA.经 DEPC 处理的水溶解 RNA材料准备及裂解尽量使用新鲜材料,植物组织选取杂质少生长较快的幼嫩部位,现取现提.组培细胞及血液应尽量离心去除培养液和上清,消化系统的组织选取杂质少的部位, 细菌和酵母需要匀浆处理.对不能马上提取的样品切成小块后立即投入液氮冷冻,或投入专门的 RNA 样品储存液中保存.液氮研磨时不要使液氮挥发净,随时补充;加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆.RNA 的提取杂质的抽提采用有机(酚/氯仿)抽提时应
14、充分混匀离心分离两相时,应保证一定的转速和时间,使蛋白质,多糖和 DNA 分布到中间层和有机相中,RNA 留在水相中对脂肪含量较多的样品注意不要吸入油质层,可以再次用有机溶剂抽提RNA 的提取RNA 的沉淀和溶解含 RNA 的水相过吸附柱,通过去蛋白液和漂洗液去除蛋白多糖等杂质或使用异丙醇沉淀 RNA 应充分的混匀并放置 10min 左右离心收集沉淀,70%乙醇洗涤,晾干用经 DEPC 处理过的水或专门的试剂来洗脱或溶解 RNA样品收集后或需长期保存时应置于-70 或加入 RNase 抑制剂,分装使用RNA 的提取RNA 的检测电泳槽系统的处理乙二醛化琼脂糖凝胶电泳含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳RN
15、A 纯度及浓度的检测(A260=1 ,约 40 g/ mL RNA;A260/A280 约为 1.9-2.1 )RNA 提取常见问题1 抽提过程不彻底存在蛋白或多糖多酚的污染2 DNA 的污染3 离子浓度较高原因对策1 保证彻底的裂解和一定转数一定时间的离心;增加有机溶剂抽提的次数,用吸附柱纯化2 减少处理样品的量;加入不含 RNase 的 DNase 处理; 再次纯化3 增加漂洗次数问题一: RNA 样品不纯RNA 提取常见问题1 样品含有杂质杂液2 样品过量或样品裂解和匀浆不彻底3 RNA 未有效的吸附沉淀或洗脱4 样品 RNA 含量少原因对策1 去除样品中的杂质,离心除净样品中的培养基或储存液2 减少样品用量;充分研磨样品 ,增加裂解液的用量和裂解的时间3 延长吸附时间或保证异丙醇沉淀的时间和离心时间;再次洗脱4 重复吸附,加入肝糖等有助 RNA 沉淀的试剂问题二: RNA 得率低RNA 提取常见问题1 样品不新鲜或样品保存不当,RNA 降解2 污染了 RNase3 样品储存不当原因对策1 尽量取新鲜的样品 ;取样后立即放入液氮保存; 或放入专门的储存液内;研磨样品及时补充液氮2 认真地处理相应的器具和试剂;严格地操作3 -70 冻存,分装使用;加入 RNase 抑制剂问题三:RNA 容易降解
