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1、1分子诊断学复习题一、概念1. 分子诊断学: 分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用基因和蛋白质分析技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的监测、诊断、疗效判断和预后评估、个体化治疗等提供信息和决策依据的一门科学。2. 酶联免疫吸附测定（ELISA ）:是以抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记为基础，反应完成后加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。3. 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）：是用镧系稀土元素螯合物标记抗体或抗原，检测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免疫分析
2、检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分析物的浓度，从而达到定量分析。而时间分辨与酶免、放免相比，因为在激发光照射后，稀土元素激发光的最大吸收波与发射光的最大发射波长之间 stokes 位移最大；发光的半衰期长（10-2000us） ，避免了杂光的影响；激发光谱宽，发射光谱窄，不必担心光谱重叠。4. 金标免疫测定: 以微孔滤膜为载体，包被已知抗原或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被的抗原或抗体结合，再通过胶体金或超顺磁性纳米微粒结合物达到检测目的。5. PCR-RFLP(限制性片段长度多态性): 聚合酶链式反应限
3、制性片段长度多态（PCRRFLP）分析技术是在 PCR 技术基础上发展起来的。DNA 碱基置换正好发生在某种限制性内切酶识别位点上，使酶切位点增加或者消失，利用这一酶切性质的改变，PCR 特异扩增包含碱基置换的这段 DNA，经某一限制酶切割，再利用琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，与正常比较来确定是否变异。应用 PCRRFLP，可检测某一致病基因已知的点突变，进行直接基因诊断，也可以此为遗传标记进行连锁分析进行间接基因诊断。用特定的限制性核酸内切酶对目的 DNA 分子进行消化，得到的酶切片断其大小和数量可以在一定程度上反映出目的 DNA 分子的序列信息。诊断遗传病和传染病病原体基因分型6. PCR-
4、SSCP(单链构象多态性): 聚合酶链反应-单链构象多态性分析，是近年来发展起来的一种基因分析方法。PCR-SSCP 分析技术是一种 DNA 单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长 DNA 单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。不同构象的单链 DNA 的迁移率不同，相同长度的 DNA 单链由于其碱基顺序不同而形成不同的构象，在电泳时表现出不同的迁移率。可以检测出突变位点的存在。用于分析癌基因和等位基因的突变，检测遗传病、免疫性疾病、传染性疾病的基因突变。7. Southern-blot: 将待检测的 DNA 分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶2电泳进行分离，
5、继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNA 或 RNA 探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。8. Northern-blot:在变性条件下将待检的 RNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot 相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。9. 窗口期: 当机体被 HIV 感染后，抗体尚未产生这段时间即为窗口期（但机体内已有HIV 存在，已具有传染性） ，但血清中可检测出 P24 抗原。
6、10. TORCH:TOX:Toxoplasma gondii 弓形虫;RV:Rubella virus 风疹病毒;CMV:Human cytomegalovirus 巨细胞病毒;HSV:Herpes simplex virus 单纯疱疹病毒11. 基因芯片: 又称 DNA 芯片或 DNA 微阵列，将大量的基因片断有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。12. 蛋白质芯片: 将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用荧光素标记蛋白质或其它成分与芯片作用，经漂洗后用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分
7、析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。 13. 缩微芯片实验室:将生命科学领域中许多不连续的分析过程，如样品制备、核酸标记、生化反应、分离检测及数据处理等，通过采用半导体光刻加工等缩微技术，集成到一块生物芯片所形成的一种便携式生物化学分析系统。14. 乙肝病人“大三阳”: “HBsAg(+)，HBeAg(+)，HBcAb(+)”1、3、5，提示患者体内HBV-DNA 呈活动性复制、传染性强，荧光定量 PCR 方法检测 HBV-DNA 阳性检出率大于95%。15. 乙肝病人“小三阳”: “HBsAg(+)，HBeAb(+)，HBcAb(+)”1、4、5 ，HBV-
8、DNA 阳性率为 80%左右，一般情况下 HBeAb(+)表明 HBV 复制处于较低水平并可能和宿主 DNA 发生整合，导致含量较低，应进行 HBV-DNA 定量检测。16. 单基因疾病:是由于染色体的一对等位基因中的一条或两条发生突变引起的疾病。17. 多基因疾病：是指疾病的发生涉及两个以上基因的结构或表达调控的改变。18. 免疫组织化学:免疫组化技术又称免疫细胞化学，以酶标记抗体（或抗原）用于免疫学检测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对细胞和组织标本中的抗原抗体复合物进行定位、定性分析和鉴定。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞
9、水平检测各种抗原。19. 化学发光酶免疫分析(CLEIA):步骤与酶免疫测定相同，仅最后一步酶反应所用底物为发光剂，通过化学反应所发出的光在特定的仪器上进行测定。标记酶：HRP、AP;发光剂：鲁米诺及衍生物、螺旋金刚烷环氧化物苯磷酸酯等20. PCR-ELISA: 在一个引物的 5端标记上生物素以便使其能与包被板上的亲合素结合而固定 PCR 产物，而在另一引物的 5端标记 FITC(荧光素)，用 HRP 标记的抗 FITC 抗体与之结合显色，即可进行常规 ELISA 检测。如设立标准对照，此技术还可用于定量分析。3二、思考题1. 标记免疫分析技术的种类及常用标记物。种类：酶联免疫吸附分析 ，免
10、疫荧光分析，放射免疫分析，化学发光免疫分析，电化学发光免疫分析，金标免疫分析，时间分辨荧光免疫分析常见示踪物:酶、放射性核素、镧系稀土元素螯合物、发光剂2. ELISA 技术类型及应用。技术类型: 双抗体夹心法测抗原，双抗原夹心法测抗体，间接法测抗体，竞争法测抗体，竞争法测抗原，捕获包被法测抗体，BAS-ELISA 法应用:(1)在医学检测中的应用：病原体及其抗体的检测 蛋白质的检测 非肽类激素的检测 药物的检测 毒品检测(2)在食品检测中的应用：食品微生物的检测 食品毒素的检测 食品中残留农药的检测 食品中残留抗生素的检测转基因食品的检测3. 双脱氧终止法测序的原理。利用 DNA 聚合酶，以
11、单链 DNA 为模板，以 dNTP(含标记的 dNTP)为底物，在四组互相独立的反应体系中分别加入不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNPT)作为链反应终止剂，根据碱基配对原则，在测序引物引导下，合成四组有序梯度的互补 DNA 链，然后通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后直接识读待测 DNA 的序列。4. PCR 的基本原理及应用。原理:是模拟体内 DNA 半保留复制过程，通过变性、退火、延伸三步反应的循环完成；靶基因的双链 DNA 通过变性解链为单链，特异的引物通；过退火与单链 DNA 模板结合，在靶DNA 的指导下引物的 3末端延伸靶 DNA 的互补链完成一个循环，重复这一过
12、程，使目的DNA 片段得到扩增。应用:目的基因的克隆；基因的体外突变；DNA 和 RNA 的微量分析；DNA 序列测定；基因突变分析5. 荧光定量 PCR 的原理。荧光定量 PCR（FQ-PCR）基于荧光能量传递技术（fluorescence resonance energy transfer FRET） ，通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用，能量从供体发色团转移到受体发色团，转移效率与两个发色团之间距离的 6 次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与 DNA 产量成正比，检测 PCR 过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。6. 荧光定量 PCR 技术（FQ-PCR）在 HBV 检
13、测中的应用。HBV 感染的早期诊断；监测治疗效果；判断病情，指导制订合理的治疗方案；在乙肝病毒耐药检测中的应用；血液制品和献血员的筛选，隐匿性肝炎的发现；HBV-DNA 定量有助于指导怀孕，降低宫内感染的发生率；4筛选肝炎的治疗药物；7. 基因芯片和蛋白质芯片的定义及其应用。(1) 基因芯片:1) 定义:又称 DNA 芯片或 DNA 微阵列，将大量的基因片断有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。2)应用:基因表达分析、DNA 序列测定、寻找新基因、基因突变和多态性的检测、疾病诊断药物筛选、疾病耐药性研究及检测、个体化医疗检测(2)蛋白芯片:1)定义:将各种蛋白质有序地固
14、定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用荧光素标记蛋白质或其它成分与芯片作用，经漂洗后用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋白质功能的目的。 2)应用:感染性疾病检测、确诊；肿瘤标记物的诊断；药物靶点筛选；构建蛋白质表达谱；进行抗原-抗体筛选；蛋白质-蛋白质相互作用等8. HIV 常用的分子诊断方法？(1)初筛试验:用于对检测对象感染情况的初步筛查，检测结果可能会有假阳性，不能发抗体阳性报告。1）血清学检测方法:酶联免疫法，颗粒凝集法，免疫荧光法，胶体硒或金法,时间分辨荧光免疫分析法2
15、)唾液检测试剂3)尿液检测试剂(2)确证试验:免疫印迹（WB） ；免疫荧光(IFA)；条带免疫(LIA)；放射免疫沉淀(RIPA)（3）抗原或核酸检测:P24 抗原检测；HIV RNA 的检测9. 常见的单基因和多基因疾病名称。(1)单基因疾病:血红蛋白病、肌营养不良症、血友病、苯丙酮酸尿症、Wilson 病、G6PD缺乏症、Huntington 病、脆性 X 综合症(2)多基因疾病:肿瘤、糖尿病、家族性高脂血症型、高血压10. 如何对一种新发传染病进行分子诊断。 对新发传染病人接触的生物、以及病人外周血、唾液、痰液等可能含有病原体的物质进行培养，对培养液进行抗原提纯进行免疫学检测、通过 RN
16、A 提取做 RT-PCR 处理、DNA 提取做 PCR 处理，电泳鉴定及测序，与已知病原体序列作比对，以发现新发传染病的病原体的科别。11. 直接和间接免疫荧光分析法需设置的对照。免疫荧光技术（FIA）直接法需设置的对照：标本自发荧光对照：标本加 12 滴 0.01mol/L pH7.4 的PBS。特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。 5间接法需设置的对照阳性对照：阳性血清+荧光标记物。阴性对照：阴性血清+荧光标记物。荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 12. 影响抗原抗体反应的主要因素。影响抗原抗体反应的因素(1)抗原抗体的性质 (2)温度 (3)酸碱度（PH） (4)电解质（离子强度）13. 放射性核素的选择原则及常见的放射性核素。选择原则: 高比活度；适宜的半衰期；对抗原和抗体损害小；容易标记常见放射核素: 14C 和 3H， 131I 和 125I， 32P， 35S14. 癌基因和抑癌基因名称。癌基因:ras
