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1、摘要。林尼厄斯的美洲花蜱的防御素（蜱螨亚纲： 硬蜱科） ，被称为 amercin（AMN ） ，被确定为是由 219 bp 的 AMN 编码区识别的。该基因编码的一个 72 个氨基酸的前导肽推测里面包含了一个 37 个 氨基酸的成熟肽。该基因显示与科赫的希伯来花蜱的防御素毫无相似之处，这是其他花蜱种类中唯一一个被发现的防御素 。与其他蜱防御素序列比较发现AMN 序列比（6 碱基对或 2 个氨基酸）林尼厄斯的肩突硬蜱（蜱螨亚纲：硬蜱科）和变异革蜱(Say)（蜱螨亚纲：硬蜱科）防御素的序列更短。 amercin 前导肽分别与肩突硬蜱和变异革蜱的前导肽有 60.8及 59.5的相似性，而 amerc
2、in 的成熟肽与这些蜱的成熟肽分别具有 73.7和 71.1的相似性。与其他蜱防御相似性范围从 42到 71。关于美洲花蜱，分别在中肠、脂肪体和唾液腺组织以及在血细胞中发现了防御素， 。防御的转录也存在于肩突硬蜱和变异革蜱早期的卵（小于 48 小时左右） ，后期卵（约 2 周） ，幼虫，这两者都是和伯氏疏螺旋体共存的。关键词。花蜱，防御，先天免疫。介绍孤星蜱，美洲花蜱，主要栖息在美国东南部，但其领土一直延伸到北部的康涅狄格州，在那里它与鹿蜱，肩突硬蜱有重叠的区域。这两种蜱具有类似的病原体，其中引起人类类似的症状。美洲花蜱能够传播查菲埃立克体，这将导致人类单核细胞埃立克体病（HME） ，并且肩突
3、硬蜱中含有粒细胞埃立克体病（HGE） （Ijdo 等， 2000） ，伯氏疏螺旋体病，莱姆病的病原体，和田鼠巴贝斯虫，像人类疟疾一样的巴贝斯虫病（Sonenshine，1993）的病原体。最近在美洲花蜱中发现包柔氏螺旋体 lonestari，与蜱相关的出疹性疾病（STARI）是南方的发病原因（James 等，2001） 。这种病，虽然还没有得到明显的特征，但是经常与包旋氏螺旋体所造成的莱姆病混淆（Oliver 等人，1998） 。很少有人对包柔氏螺旋体lonestari 进行研究，因为它最近才培养出来（瓦雷拉等，2004） 。相反，包氏螺旋体的感染过程得到了很好的研究和表征。节肢动物缺乏脊椎动
4、物的高度发达的器官，适应性免疫系统和依靠性，相反，它是依靠先天的免疫系统来对抗入侵的病原体。这些先天免疫系统包括细胞和可溶性应答（吉莱斯皮等人，1997; 施密德，汉帛，2005） 。细胞反应，包括细胞吞噬功能，封装和结瘤，它可以吞噬掉这些病原体。通常，这些免疫细胞识别病原体相关的分子模式有（PAMP） ，如脂多糖，肽聚糖或其它细菌的结构部件。溶于反应包括表现出对入侵的细菌细胞毒性作用的抗微生物肽的释放（吉莱斯皮等人，1997;甘兹， 2003 年，2005 年） 。通过对脊椎动物和无脊椎动物的分析发现防御素是一个家族性的抗菌肽，其通过引入电压依赖性通道进入细菌膜消灭入侵的细菌（Cocianc
5、ich 等人，1993; Saido-Sakanaka 等， 1999） 。防御素肽由前导肽与成熟肽组成，通常长度范围从 29 到 34 个氨基酸，并且是约 4 kDa 的大小（Cociancich 等人，1993;的Gillespie 等人，1997） 。昆虫和节肢动物成熟的防御在一级结构上具有 6 个半胱氨酸残基，形成三个二硫键。二硫键的破坏导致抗微生物活性的损失。节肢动物防御素的半胱氨酸和二硫键的相对间隔是保守的（Cociancich 等人，1993） 。在微生物中，抗微生物肽，包括防御素，在微生物紧密组织间被表达（考克和斯科特，2000） 。 对于许多病原菌，包括伯氏均属，通过从被感染
6、的哺乳动物宿主的消化系统中吸血的摄入量，获得进入该载体的途径。对于该螺旋体属。螺旋体可以附着到肠上皮细胞（松尾等人，2004;帕尔等人，2004） 。当被感染的蜱引发另一个模式，螺旋体穿透肠组织从而进入血淋巴。它们通过血淋巴到唾液腺，在那里他们可以通过唾液分泌物被转移到新的宿主细胞中。血淋巴还允许病原体进入各种蜱组织（约翰等人，2001; ，2004 松尾等人） 。在昆虫中防御素 主要生产部位是脂肪体（霍夫曼，1997 年） ，是 PAMP 识别的部位。防御的主要分泌部位是微小牛蜱（Canestrini）的血细胞和脂肪体（Fogaca 等，2004）;毛白钝缘蜱（沃尔顿意义上）的防御素 D 在
7、脂肪体中也被完全表达（中岛等人，2002） 。毛白钝缘蜱防御素的异构体 A、B 和 C，主要在中肠中被表达。肩突硬蜱和变异革蜱的防御素似乎主要是由血细胞表达（Ceraul，2005） 。已经提出了从这些蜱生产防御素血细胞中提取一些保留，直到需要。在挑战他们，然后分泌肽进入血淋巴（Ceraul 等，2003） 。由于脂肪体的作用是识别病原体并且能密切接触疏螺旋体菌。伴随中肠，血细胞和唾液腺，这些组织都是防御素的表达的主要部位。我们假设，在疏螺旋体菌共存与非共存之间的防御素的表达存在差异。只允许非共存形式，消灭入侵的螺旋体，以防止传染给新的宿主。在美洲花蜱中进行组织分布和寿命末期的分布研究， ，并
8、与肩突硬蜱的结果进行比较，这两种形式，以确定防御素在这些蜱和非共存关系之间的表达差异。 材料和方法 勾选饲养 美洲花蜱由俄克拉何马州立大学的 Stillwater，OK，USA 提供的。肩突硬蜱是从松树岭国家公园（近纽约 Armonk U.S.A）采集的，正如以前描述的那样（Sonenshine， 1993） ，蜱饲养在新西兰大白兔上（Oryctologus cunniculus） 。所有动物的程序进行，都是根据旧统治大学实验动物管理和使用委员会批准的方案 04- 001.Amercin 转录和序列测定为了获得美洲花蜱防御素基因的序列，这不包括角质层和附属物的防御素基因的序列，在自然条件下对雌
9、蜱喂养大约 1 周左右收集到 RNA 酶（核糖核酸酶） 。使用微小的QuickPrep mRNA 纯化试剂盒（ Amersham Biosciences 公司，Piscatasay，NJ，USA ） 。先是用 DNA-freeTM 试剂盒处理（ Ambion 公司，奥斯汀，TX，USA） ，然后进行乙醇沉淀。（表 1，图 1）如果试剂盒没有提供引物的话，从整合的 DNA 技术中获得引物（科尔维尔，IA，USA） ，培养在 25下 5 分钟，在 37下 1 小时， ，在 70下 15 分钟，聚合酶链反应（PCR）伴有寡聚 dT 和 Is2b，对应于成熟防御素起始序列的基因特异性引物 ，用Supe
10、rmix 高保真技术（Invitrogen 公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州进行，USA）与以下程序：94 1min94 1min42 1min 34cys72 1min72 10min从 GeneRacer 试剂盒（Invitrogen）中，得到转录的 5部分。 ，利用上面获得的的 3序列引物 Amb- GSP2 进行反转录。使用铂金 Supermix 高保真度（Invitrogen 公司） ，使用套式引物 AMB-GSP1，并提供了 GeneRacer 的引物使用下列程序进行 PCR，94 2min94 1min58 1min 34cys72 1min72 10min以 3和 5序列所覆盖区
11、域，以获得完整的转录的序列;生成的基因特异性的引物对应于基因编码区（分别 AMB-ATG 和 AMB-TAG，分别）的起始和终止。 PCR 是用 RT 产物的这些引物进行 PCR， ， （使用寡聚 dT 的引物获得）用于确定 5序列的。克隆和测序逆转录-PCR 产物克隆入 pCR4-TOPO 中，并转化到 TOP 10 化学感受态大肠杆菌细胞（Invitrogen）中。提取质粒 DNA 使用向导加上 SV 微量制备 DNA 纯化系统并且插入Biosystems 公司 Big Dye 终止测序试剂盒中的 M13F 或 M13R 引物序列。用福斯特和运行ABI 棱镜 3130xl 基因分析仪，序列
12、分析和比对进行是使用 Vector NTI 程序套件(Invitrogen)。Table 1. 在本研究中使用的引物图 1.引物在 ANA 基因的位置，位于转录内组织生命阶段的分析从无 RNA 酶的条件下饲养大约一周左右的美洲花蜱中分离出中肠，脂肪体和唾液腺。组织被直接收集在 mRNA 提取试剂盒提供的提取缓冲液。 将雌性美洲花蜱的血淋巴中加入磷酸盐缓冲盐水（PBS） ，并在 1400g 下离心 20 分钟。此外除去血浆的血细胞重新浸泡在 mRNA 提取试剂盒提供的提取缓冲液。将从美洲花蜱和肩突硬蜱中收集的早期阶段的卵，后期卵，放入无 RNA 酶的条件下的 mRNA 提取试剂盒提取缓冲液中。个
13、别组织和生命阶段提取的 mRNA 也做如上处理。逆转录反应利用 Im-PromII 逆转录酶试剂盒（Promega）进行的，并寡聚 dT 引物也和上面描述的一样。 A PCR（94 1min94 1min（） 1min 美洲花蜱为 50 ,肩突硬蜱为 58 34cys72 1min72 10min技术在使用美洲花蜱中的基因特异性引物 Amb-ATG 和 Amb-TAG 和肩突硬蜱中的 Ix-ATG和 Ix-TAG 引物进行 RT 的制备。对 PCR 产物进行克隆和测序如所述进行。从美洲花蜱的血细胞中得到的防御序列的位置对应 GenBank 中的登录号为 DQ864986。结果 Amercin
14、序列从美洲花蜱的血细胞中得到的全长转录序列（556 个核苷酸）的防御素被确定。在该防御素中一个 219-bp 的基因编码区被确定，这里称为 amercin（AMN） 。该 amercin 基因编码了一个 72-氨基酸的前导肽与假定有 37 个氨基酸的成熟肽。该序列含有 6 个半胱氨酸残基，其与其他节肢动物和昆虫防御素中保守的半胱氨酸和显示相似性的其他蜱和昆虫防御素的配合( Tables 2 and 3 ) 核苷酸与 amercin 中前体防御素的相似范围从 42.6到 71.6,成熟防御素为 48.7到 71.8。翻译的 amercin 蛋白前体防御素相似的范围从 26.2到 71.6和成熟防
15、御素范围从 42.1到 73.7。希伯来花蜱是这些蜱属中唯一一个发现防御素的蜱。这种蜱，它栖息非洲的亚热带地区，拥有两个防御素的蛋白质。有趣的是，这两个防御素，称为 A 和蜱防御素肽-2 ，是阴离子（Lai 等人， 2004） 。阴离子抗菌肽在哺乳动物中已经被发现过（Fales-Williams e t al. , 2002)，但在蜱中还未发现有任何阴离子防御素被确认（Lai et al. , 2004 )。该 amercin 前导肽和蜱防御素肽-1 共享 29.1的氨基酸相似性和蜱防御素肽 -2 具有 26.2的氨基酸相似性。Amercin 的成熟肽对花蜱防御素肽-1 和肽-2 相似度分别为
16、 44.742.1。在核苷酸水平上，成熟 amercin 与花蜱防御素肽-1 和肽-2 相似度分别为 48.7和 52.1。因此，amercin 与变异革蜱和肩突硬蜱防御素的亲缘关系要比希伯来花蜱防御素的亲缘性大 该 amn 核苷酸序列是比肩突硬蜱的 scapularisin（SLN）和变异革蜱 varisin（VSN ）防御素基因更短的只要 6bp 大小的氨基酸序列。 amercin 肽是比 scapularisin 和 varisin 的序列少 2 个氨基酸导致了不同的结果，分别在成熟区域和前原区域缺少 1 个氨基酸。上述对比表明，美洲花蜱的防御相对于肩突硬蜱和变异革蜱的共存的防御素的对比来说，与前者更为相似。组织生命阶段的表达在所有生命阶段的调
