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1、斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究摘要: 体外检测了 3 株斜带石斑鱼( Epinephelus coioids) 肠道乳酸菌的产乳酸能力、抑菌活性、对高温、低 pH 值、高胆盐、人工胃液及人工肠液的耐受能力等，为海水鱼益生菌的开发提供理论依据16S rNA 基因测序分析表明，LS61、LS64、LS77 菌株分别为植物乳杆菌( Lactobacillus plantarum) 、肠膜明串珠菌( Leuconostoc mesenteroides) 、糊精乳杆菌( Lactobacillus dextrinicus) 3 株菌摇瓶培养 40 h 后发酵液中乳酸含量分别达到 55. 6、51
2、. 6、58. 3 mmol / dm3且发酵上清液对致病菌有较强的拮抗活性 耐受性实验结果表明，pH 值为 3. 5、4. 5 的 MS 培养基对这 3 株菌存活影响较小; pH 值为 2. 5 的 MS 培养基对 LS64、LS77 的影响较大，而对 LS61 菌株的存活基本没有影响 这 3 株菌对不同 pH 值的人工胃液的耐受性与之相似，说明 LS61 菌株的 pH 值耐受性最好，其次是 LS64 菌株，LS77 菌株最差 3 株菌对高胆盐也有不同的耐受性，含 1和 2胆盐的 MS 培养基对 3 株菌的影响较小，而在 3的胆盐处理 4. 5 h 后，LS64 菌株的存活率仍保持在 30.
3、 7%，LS61 菌株的存活率为 2 0% 左右，LS77 菌株的存活率接近 1 0% 在 4的胆盐含量下，LS61、LS64 菌株的存活率仍高于 1 同样，不同胆盐含量的人工肠液对这 3 株菌的影响与之相似 乳酸菌 LS61、LS64 菌株具有较强的产乳酸和抑菌能力，具有一定的 pH 值耐受性和较高的胆盐耐受性，可考虑作为潜在的益生菌株应用于水产健康养殖关键词: 海洋生物学; 斜带石斑鱼; 乳酸菌; 抑菌活性; pH 值; 胆盐; 益生菌随着石斑鱼养殖的兴起和高速发展，在带来巨大经济效益的同时也出现了一些问题 石斑鱼细菌性疾病和寄生虫病害严重，抗生素等药物的频繁使用导致致病菌耐药性的增强，解
4、决这些问题就需要探寻一种绿色的养殖模式，需要一种高效生态的方法来控制细菌性病害 因此，许多科学家都期望利用微生物之间的拮抗作用预防和治疗石斑鱼细菌性疾病1-3乳酸菌作为益生菌已被广泛应用于人体的保健医疗、健康和食品等多个方向 如 Youn 等( 2012) 用流感病毒感染 BALB/c 小白鼠，发现活的乳酸菌对增强免疫有显著效果，提高了小白鼠的存活率4Matsumoto 等( 2006 ) 研究证实含乳酸菌的牛奶对稳定人体肠道环境和微生物菌群具有积极作用5 Burns 等( 2012) 从奶酪中分离得到 2 株乳酸菌，将其用于发酵奶酪，与不加乳酸菌的对照组进行氨基酸含量、食品风味等进行比较，发
5、现添加乳酸菌发酵的奶酪中氨基酸含量和风味明显好于对照组6 乳酸菌在畜禽养殖上的应用也取得了较大进展，如 Zhang 等( 2012) 发现罗伊乳酸杆菌( Lactobacillus reuteri) 能提高患白痢雏鸡的存活率7 此外，乳酸菌在水产养殖上的应用也取得了一定成果，如刘倩等( 2006) 阐述了乳酸菌对提高鱼类抗病力、生长速度和存活率的重要作用8;Lara-Flores 等( 2003 ) 发现将粪链球菌 ( Streptococ-cus faecium) 和嗜酸乳杆菌 ( Lactobacillus acidophi-lus) 添加到饲料中投喂可以促进尼罗罗非鱼( Ore-ochr
6、omis niloticus) 鱼苗的生长，提高饲料利用率等9; Suzer 等( 2008) 研究发现，乳杆菌投喂处理等显著提高金头雕( Sparus aurata) 幼体的存活率、4 期 陈艳武，等: 斜带石斑鱼肠道乳酸菌部分生物学特性研究 531特定生长率和肠道酶活10尽管乳酸菌在水产养殖上应用的报道不少，但是，由于缺乏真正适合水产动物的益生菌株，目前许多水产上使用的益生菌分离自环境或者陆生动物，这些益生菌往往因为无法在水产动物消化道存活而不能发挥益生效果，因而限制了它们在水产养殖上的应用 理想的益生菌应该来自动物自身胃肠道11-13 此外，所选用的益生菌还必须能够耐胃肠内强酸、高胆盐的
7、环境，才能够在消化道内大量存活、定植，发挥益生作用14-15本文通过分离斜带石斑鱼( Epinephelus coioids)肠道的乳酸菌，对其部分生物学特性，包括产乳酸的能力、抑制病原指示菌的能力，以及耐受低 pH 值和高浓度胆盐的能力等进行了研究，初步评价乳酸菌作为益生菌应用于石斑鱼养殖的可能性1 材料与方法1. 1 菌株的分离与鉴定1 1. 1 乳酸菌的分离纯化 实验所用的斜带石斑鱼购自厦门市大学路菜市场 取健康活泼的斜带石斑鱼 4 尾，用 75% ( V/V) 酒精棉球擦拭鱼体表面，在紫外灭菌后的超净工作台中解剖胃肠道，取消化道内容物和消化道粘膜用无菌生理盐水制备成匀浆液，将匀浆液 1
8、0 倍梯度稀释至 10 4 取原液和各个梯度稀释液各 100 mm3分别涂布 MS 平板，每个梯度设 3 个重复，平板置于 28恒温培养5 d 挑取各种类型单菌落接种至 MS 平板上，多次划线传代，直至镜检确认纯种 对单菌进行接触酶实验，选取接触酶阴性的菌株进行 16S rNA 测序鉴定1 1. 2 乳酸菌的鉴定 利用细菌基因组 DNA 提取试剂盒( 上海赛百盛基因技术有限公司) 提取细菌基因组 DNA 以细菌通用引物 27f ( 5-AGA GTTTGA TCC TGG CTC AG-3) 和 1492r ( 5-ACG GCTACC TTG TTA CGA CT-3) 扩增细菌 16S r
9、NA 基因片段 PC 反应条件:94 4 min;94 40 s，55 40 s，72 1. 5 min，35 个循环; 72 10 min 用 1. 0% 的琼脂糖凝胶电泳检测 16S rNA 基因扩增产物，扩增产物送上海英骏( Invitrogen) 生物技术有限公司进行纯化和测序，序列于 GenBank 网站上进行 BLAST比对分析1 1. 3 病原指示菌 抑菌试验所用的指示菌哈维氏弧菌( Vibrio harveyi) QBY3 为本实验室分离自患病斜带石斑鱼眼球部位，坎贝氏弧菌( Vibrio camp-bellii) VH1 为本实验室分离自患发光病南美白对虾( Litopena
10、eus vannamei) 体内16，嗜水气单胞菌( Aeromonas hydrophila) SHI 为山东大学杜宗军老师惠赠，实验证实 3 株菌对南美白对虾和斜带石斑鱼均具有中等强度的致病性 指示菌均用 216L培养基培养1. 2 乳酸菌产酸能力的测定将用液体 MS 培养基活化好的乳酸菌以 5%( V/V) 的接种量接入新鲜的 MS 培养基中，摇瓶培养，每隔 4 h 取样测 pH 值和乳酸含量 乳酸含量采用南京建成生物工程研究所的乳酸测定试剂盒进行测定1. 3 发酵上清液抑菌实验采用琼脂板打孔法进行抑菌实验 发酵上清液的制备: 将用液体培养基活化好的乳酸菌以5 % 的接种量接入新鲜的 M
11、S 培养基中，摇瓶培养 48 h，4 条件下 6 300 r/min 离心 20 min，取上清用 0. 22 m 滤器过滤后进行抑菌试验 分别用乳酸调 MS 液体培养基至与 3 株菌培养发酵上清液相同的 pH 值，作为对照进行抑菌试验 分别测定乳酸菌 48 h 发酵上清液和对照液的抑菌圈直径1. 4 温度对菌株存活的影响在 MS 培养基中接入已活化好的菌种，初始浓度保持在 106数量级，然后于 28、40、60、80 处理0、0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h，取样涂板计数，每个处理 3个重复1. 5 pH 值对菌株存活的影响试验设置了 4 个 pH 梯度处理: 1. 5、2. 5、
12、3. 5、4. 5 分别用 1 mol / dm3的 HCl 调节 MS 液体培养基至上述 pH 值 把用液体 MS 培养基活化好的LS61、LS64、LS77 菌株以 5% 的接种量分别接种至上述各 pH 梯度处理，28静置培养 在接种初始及接种后 0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h 取样涂板计数，每个处理 3 个重复1. 6 胆盐含量对菌株存活的影响试验设置了 1、2、3、4( m/m) 共 4 个胆盐含量梯度处理组，分别用胆盐调节 MS 液体培养基至上述浓度 把用液体 MS 培养基活化好的 LS61、LS64、LS77 菌株以 5% 的接种量分别接种上述各处理，28静置培养 在接
13、种初始及接种后0. 5、1. 5、3. 0、4. 5 h 取样涂板计数，每个处理 3 个重复1. 7 菌株在人工胃液和人工肠液中的存活人工胃液和人工肠液的配制参照文献17的方法，人工胃液中含有 1%( m/m) 的胃蛋白酶，人工532 应 用 海 洋 学 学 报 32 卷肠液中含有 1%( m/m) 的胰蛋白酶 把用液体 MS培养基活化好的菌种以 5% 的接种量分别接种于上述 pH 值为 2. 5、3. 5、4. 5 的人工胃液中，28 静置培养，接种初始及接种后 1. 5 h 取样稀释涂板计数把用液体 MS 培养基活化好的菌种以 5% 的接种量分别接种于上述胆盐浓度值为 1、2、3、4的人工
14、肠液中，28 静置培养，接种初始及接种后3. 0 h 取样稀释涂板计数，计算存活率1. 8 数据处理文中 pH 值、乳酸含量、抑菌圈直径和活菌数量均为 3 个重复的平均值，数据用统计软件 SPSS19. 0单因子多重比较中的 Duncan 进行统计学方差分析，以平均值 标准差表示2 结果与分析2. 1 3 株乳酸菌的 16S rNA 鉴定结果如表 1 所示，根据菌株的 16S rNA 基因测序分析结果，LS61 鉴定为植物乳杆菌( Lactobacillus plan-tarum) ，LS64 鉴定为肠膜明串珠菌( Leuconostoc mes-enteroides) ，LS77 鉴定为糊精
15、乳杆菌 ( Lactobacillusdextrinicus) 2. 2 乳酸菌发酵液的抑菌活性在培养 48 h 的条件下，这 3 株乳酸菌发酵液对病原指示菌的抑制结果如表 2 所示由表 2 可知，这 3 株乳酸菌发酵液对哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌和嗜水气单胞菌均有较强的抑制效果，抑菌圈直径都在 15 mm 以上 而对照组( 用乳酸调 MS 培养基 pH 值至与培养发酵液相同) 对这 3指示菌也有一定的抑制作用，但明显弱于乳酸菌发酵液对其的抑制作用，差异显著( p 0. 05) 推测这3 株乳酸菌的抑菌作用一方面是由于低 pH 的作用，另一方面是由于乳酸菌本身产生除乳酸以外的其他抑菌物质表 1 3
16、 株乳酸菌菌种鉴定结果Tab 1 Identification of lactic acid bacteria菌株 最近源模式种 相似度/% NCBI 登录号LS61 Lactobacillus plantarum ATCC 14917( T) 100. 0 KC700038LS64 Leuconostoc mesenteroides ATCC 8293( T) 99. 9 KC700039LS77 Lactobacillus dextrinicus JCM 5887( T) 99. 9 KC700040表 2 乳酸菌发酵液对 3 种病原指示菌的抑制效果比较Tab 2 Inhibition effects of lactic acid bacte
