《常见的报告基因》由会员分享，可在线阅读，更多相关《常见的报告基因（2页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、常见的报告基因报告基因必须具备的特点：由原核基因编码的基因产物必须与同转染前真核细胞内任何相似的产物相区别；细胞内其他基因产物不会于扰报告基因产物的检测；报告基因编码产物的检测应该快速、简便、灵敏度高，而且重现性好。到目前为止，报告基因通常是在报告基因载体质粒中与被检测基因序列相连，先让质粒在大肠杆菌中进行增殖，再提取质粒，转染人感兴趣的真核细胞中。与此同时还要将有真核启动子和增强子的另一种报告基因质粒共转染同一细胞，作为转染率的内对照。(1)氯霉素乙酰基转移酶(CAT) ：该报告基因来源于大肠杆菌转位子 9，是第 1 个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰 CoA
2、的乙酰基转移到氯霉素 3 羟基，而使氯霉素解毒。CAT 在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定(enzymelinkedimmunosorbantassay ，ELISA)检测其活性，也可进行蛋白质印迹(Westernblotting)和免疫组织化学分析。CAT 与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。(2) 半乳糖苷酶： 半乳糖苷酶由大肠杆菌 lacZ 基因编码，可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻硝基苯D半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物可用标准的比色法检测
3、酶活性，其检测动力学范围为 6 个数量级。氯酚红D半乳吡喃糖苷(CPRG)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比 ONPG 高近 10 倍。以 MUG 和荧光素二半乳糖苷(FDG)为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(FACS)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。(3)荧光素酶：荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶，哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和 Renilla 荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在
4、哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高，检测线性范围宽达 78 个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因，用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。Renilla 荧光素酶催化肠腔素(coelenterazine)氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自 1986 年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用。Promega 公司的 pGL3 及 pGL2 系列载体，
5、含 SV40 启动子及增强子的不同组合，有助于分析 DNA 片段的转录活性。荧光素酶报告基因有许多优点：非放射性；比 CAT 及其他报告基因速度快；比 CAT 灵敏 100 倍；荧光素酶在哺乳细胞中的半衰期为 3 小时，在植物中的半衰期为 35 小时。由于半衰期短，故启动子的改变会即时导致荧光素酶活性的改变，而荧光素酶不会积累。相反，CAT 在哺乳细胞中的半衰期为 50 小时。荧光素酶浓度在 1016molL(10pSL)到 10-8molL(1mgL)范围内，荧光信号强度与酶浓度成正比。在理想条件下，可检测到 l0-20molL 的荧光素酶。Promega 公司的荧光素酶检测系统比一般的方法
6、灵敏及简单，产生的光稳定。(4)分泌型碱性磷酸酶(SEAP)：SEAP 是人胎盘碱性磷酸酶的突变体，无内源性表达。SEAP 缺乏胎盘碱性磷酸酶羧基末端的 24 个氨基酸。其优点是无需裂解细胞，只用培养介质即可检测酶活性，便于进行时效反应试验。以间硝基苯磷酸盐(PNPP)为底物时可用标准的比色法测定酶活性，操作简单，反应时间短，价格廉价，但灵敏度低。以黄素腺嘌呤二核苷酸磷酸为底物进行比色测定，其灵敏度增高。SEAP 可催化 D荧光素O磷酸盐水解生成 D荧光素，后者又可作为荧光素酶的底物，此即两步生物发光法检测酶活性的原理。此方法灵敏度高，接近于荧光素酶报告基因的检测。还可用一步化学发光法检测酶活
7、性。(5)荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为 20 00030 000 的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP) 是应用最多的发光蛋白。GFP 存在于发光水母(AequoreaVictoria)中。用 395 Bin 的紫外线和 475 nm 的蓝光激发，GFP 可在 508nm 处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。 GFP 最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991 年克隆了 GFP 基因，目前已获得几个突变体，如 “红色迁移”突变体(redshiftmutant)，其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白(BFP) 、增强型 GFP(EGFP)和去稳定 EGFP(destabilizedEGFP)等。红色荧光蛋白(RFP)是从珊瑚(Discosoma sp)中分离的发光蛋白(drFP583 或 DsRed)，可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测 2 个甚至3 个基因的表达。报告基因的选择依赖于其灵敏性、可靠性及监测的动力学范围。稳定性好的报告基因适于基因转录动力学研究和高通量筛选，尤其适用于基因转移的定性研究。
