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1、10鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9 亚型） 、传染性法氏囊病四联灭活疫苗（La Sota 株+M41 株+YBF003 株+S-VP2 蛋白）制造及检验试行规程(草案)本品系用鸡新城疫病毒 La Sota株、传染性支气管炎病毒 M41株、H9 亚型禽流感病毒 YBF003株分别接种易感鸡胚培养、收获感染胚液、超滤浓缩后经甲醛溶液灭活；鸡传染性法氏囊病毒系用表达鸡传染性法氏囊病病毒 VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌 E.coli BL21/pET28a-VP2（简称 S-VP2蛋白）经过发酵培养、诱导表达、菌体破碎、离心去除菌体碎片、提纯、灭活残留细菌；将四种抗原按适当比例混合后加入
2、优质油佐剂，混合乳化制成。用于预防鸡新城疫、传染性支气管炎、H9 亚型禽流感和传染性法氏囊病。1 毒种1.1 毒种来源 制造本品用的鸡新城疫病毒 La Sota株、效检用鸡新城疫强毒北京株(CVCC AV1611株） 、鸡传染性支气管炎病毒 M41株、传染性法氏囊病病毒 BC6-85株（CVCC AV7株）均购于中国兽医药品监察所，由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保管和供应；鸡传染性法氏囊病生产用菌种为表达鸡传染性法氏囊病病毒 VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌，菌株名称为 E.coli BL21/pET28a-VP2（简称 S-VP2蛋白） 、A 型禽流感病毒（H9 亚型）A/Chicke
3、n/shandong/11/05（H9N2）株（简称 YBF003株） ，由青岛易邦生物工程有限公司鉴定、保存和供应。1.2 毒（菌）种标准1.2.1 鸡新城疫病毒 La Sota株应符合下列标准1.2.1.1 对鸡脑内致病指数（ICPI） 应为 0.10.4。1.2.1.2 对鸡胚最小致死量的平均死亡时间（MDT/MLD） 应为 103119小时。1.2.1.3 对鸡胚的毒力 将毒种用灭菌生理盐水作 100倍稀释，尿囊腔内接种 10日龄 SPF鸡胚 10个，每胚 0.1ml，置 3637继续孵育，鸡胚应于接种后 24120 小时死亡 7个，胎儿须有明显充血、出血病痕。1.2.1.4 红细胞凝
4、集价 按现行中国兽药典进行测定，含毒鸡胚液对鸡红细胞凝集价应不低于 1:512（微量法） 。1.2.1.5 病毒含量 将含毒鸡胚液用灭菌生理盐水作 10倍系列稀释，取10-7、10 -8、10 -9 3个稀释度，各尿囊腔内接种 10日龄 SPF鸡胚 5个，每胚0.1ml，置 3637继续孵育，48 小时内死亡的鸡胚弃去不计，在 48120 小11时内死亡的鸡胚随时取出，收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至 120小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于 1:128（微量法）者判为感染，计算EID50，每 0.1ml病毒含量应10
5、8.0EID50。1.2.1.6 安全性 用 27 日龄 SPF雏鸡 20只，分为两组，第 1组 10只，每只滴鼻接种 5倍稀释的含毒胚液 0.05ml；第 2组 10只，不接种作为对照。两组在同条件下分别饲养管理，观察 10日，应无不正常反应。如有非特异性死亡，免疫组和对照组均应不超过 1只。1.2.1.7 免疫原性 对 30日龄 SPF雏鸡滴鼻免疫，最小免疫剂量应5000EID 50。1.2.1.8 特异性 将毒种用灭菌生理盐水作 1000倍稀释（约 含105.0EID50/0.1ml） ，与等量抗新城疫病毒特异性血清混合，置室温中和 1小时后，尿囊腔内接种 10日龄 SPF鸡胚 10个，
6、每胚 0.2ml；同时设病毒对照 10个，尿囊腔内接种 1000倍稀释的病毒液，每胚 0.1ml，观察 120小时。在 24120 小时内中和组鸡胚应不引起特异性死亡且至少存活 8个，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性；对照组鸡胚应至少死亡 7个，且鸡胚液作红细胞凝集试验应为阳性。1.2.1.9 纯净 按现行中国兽药典进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。1.2.1.10 基础种子代数 E4-1E4-10 代。1.2.1.11 毒种保存 在-70以下保存，有效期为 72个月。1.2.2 鸡新城疫病毒北京株(CVCC AV1611 株）应符合下列标准1.2.2.1 对鸡最小致死量 用 2
7、8 月龄 SPF鸡 4只，各肌肉注射 10-7或10-8稀释度的病毒液 1ml，14 日内应全部死于新城疫。1.2.2.2 对鸡胚半数致死量 将毒种作 10倍系列稀释，取 10-6、10 -7、10 -8 3个稀释度，各尿囊腔内接种 10日龄 SPF鸡胚 5个，每胚 0.1ml，记录接种后 2472 小时死亡且胎儿病痕明显的鸡胚，计算 ELD50，每 0.1ml病毒含量应10 7.0ELD50。1.2.2.3 纯净性 按现行中国兽药典进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。1.2.2.4 毒种保存 在-70以下保存，有效期为 72个月。121.2.3 传染性支气管炎病毒 M41株应符合
8、下列标准1.2.3.1 对鸡胚的毒力 将毒种用灭菌生理盐水作 10倍稀释，尿囊腔内接种 10日龄 SPF鸡胚 10个，每胚 0.1ml，鸡胚应于接种后 24144 小时内全部或部分死亡。存活的鸡胚应表现胎儿失水、卷缩、发育小等特异性病痕，其尿囊液对 1%鸡红细胞凝集试验应为阴性。1.2.3.2 病毒含量 每 0.1ml 病毒含量应不低于 106.0EID50。1.2.3.3 对雏鸡的毒力 用 17 日龄 SPF鸡 10只，每只以 10倍稀释的毒种滴鼻 12 滴（0.0250.050ml） ，观察 10日，至少应有 8只出现鸡传染性支气管炎的典型症状。1.2.3.4 特异性 将毒种用灭菌生理盐水
9、稀释 100倍（含104.0EID50/0.1ml） ，与等量鸡抗传染性支气管炎特异性血清混合，置室温中和1小时后，尿囊腔内接种 10日龄 SPF鸡胚 10个，每胚 0.2ml；同时设病毒对照10个，尿囊腔内接种 100倍稀释的毒液，每胚 0.1ml，观察至 144小时。在24144 小时内中和组鸡胚应无特异性死亡及鸡胚病变，对照组鸡胚死亡和出现特异性病变的胎儿总数应至少 8个。1.2.3.5 免疫原性 将毒种接种 10日龄 SPF鸡胚繁殖，取病毒含量 106.0EID50/0.1ml的鸡胚液，灭活后按 1:3（水相:油相）的比例制成灭活疫苗。用 1442 日龄 SPF鸡 25只，20 只各点
10、眼、滴鼻接种传染性支气管炎活疫苗（H120 株）1 羽份（0.05ml） ，另 5只不接种作为对照。接种后 2128 日，分别采血，分离血清，再颈部皮下或肌肉接种灭活疫苗 0.3ml/只，第二次接种后2128 日，再分别采血，分离血清，将两次血清分别作 HI抗体效价测定。免疫组二免血清 HI抗体效价的几何平均值（GMT）应较首免血清高 4倍以上，对照组血清 HI抗体效价的几何平均值应不高于 1:8（微量法） 。1.2.3.6 纯净 按现行中国兽药典进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。1.2.3.7 基础种子代数 E1E6 代。1.2.3.8 毒种保存 在-70以下保存，有效期为 7
11、2个月。1.2.4 禽流感病毒 YBF003株应符合下列标准1.2.4.1 对鸡胚的毒力 将毒种用灭菌生理盐水作 10000倍稀释(约含103.0EID50/0.1ml),尿囊腔内接种 1011 日龄 SPF鸡胚 10个，每胚 0.1ml，置3637继续孵育，在接种后 60120 小时内，应至少有 8个鸡胚死亡。胎儿13应表现全身出血、明显水肿、肝脏坏死等病变。1.2.4.2 对雏鸡的毒力 将毒种用灭菌生理盐水作 10倍稀释，经翅静脉接种 2856 日龄 SPF鸡 10只，每只 0.2ml，接种后 14日内，应不出现死亡或明显异常反应；接种后 35 日，采集每只鸡的泄殖腔拭子，经处理后，分别经
12、尿囊腔接种 1011 日龄 SPF鸡胚 5个，每胚 0.2ml，孵育观察 5日，无论死胚、活胚均应测定红细胞凝集价，每个拭子样品接种的 5个鸡胚中只要有 1个鸡胚液的红细胞凝集价不低于 1:16（微量法） ，即可判为病毒分离阳性；对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。应至少 9只鸡病毒分离阳性。1.2.4.3 病毒含量 将毒种用灭菌生理盐水作 10倍系列稀释，取 10-6、10 -7、10 -8 3个稀释度，各尿囊腔内接种 1011 日龄 SPF鸡胚 5个，每胚0.1ml，置 3637继续孵育，每日照胚 2次，24 小时以前死亡的鸡胚弃去不计，在 24120 小时内死亡的鸡胚随时取出，
13、收获鸡胚液，同一稀释度的胚液等量混合，按稀释度分别测定红细胞凝集价，至 120小时，取出所有活胚，逐个收取鸡胚液，分别测定红细胞凝集价，凝集价不低于 1:16(微量法)者判为感染，计算 EID50，每 0.1ml病毒含量应10 7.0EID50。1.2.4.4 红细胞凝集价（HA） 毒种对鸡红细胞凝集价（ HA）应不低于1:256(微量法)。1.2.4.5 毒种特异性1.2.4.5.1 血凝抑制试验 毒种与抗 H9亚型禽流感病毒特异性血清应为阳性反应，与 SPF鸡血清、禽流感（H5、H7 亚型）阳性血清、鸡新城疫阳性血清、减蛋综合征阳性血清均应为阴性反应。1.2.4.5.2 鸡胚中和试验 将毒
14、种用灭菌生理盐水作 1000倍稀释，与等量抗 H9亚型禽流感病毒特异性血清混合，室温中和 1小时后，尿囊腔内接种10日龄 SPF鸡胚 10个，每胚 0.2ml；同时设病毒对照 10个，尿囊腔内接种1000倍稀释的病毒液，每胚 0.1ml，观察 120小时。在 24120 小时内中和组鸡胚应无特异性死亡，且应至少有 9个健活，鸡胚液作红细胞凝集试验，应为阴性反应；对照组鸡胚应至少有 8个死亡，且鸡胚液作红细胞凝集试验均应为阳性反应。1.2.4.6 免疫原性 取红细胞凝集价不低于 1:256(微量法)的鸡胚液，灭活后按 1:3（水相:油相）的比例制成灭活疫苗，颈部皮下接种 2128 日龄 SPF鸡
15、 10只，每只 0.2ml，另取 10只不接种作为对照。21 日后采血，分离血清，14测定 HI抗体效价，同时翅静脉注射 10倍稀释的 YBF003株病毒液，每只0.2ml，于攻毒后 35 日采集泄殖腔拭子，经处理后，尿囊腔接种 1011 日龄SPF鸡胚 5个，每胚 0.2ml，孵育观察 5日，无论死胚、活胚均应测定鸡胚液红细胞凝集价，每个拭子样品接种的 5个鸡胚中只要有 1个鸡胚液的凝集价不低于 1:16（微量法） ，即可判为病毒分离阳性。对病毒分离阴性的样品，应盲传一次后再进行判定。免疫组血清 HI抗体效价的几何平均值应不低于 1:180（微量法） ，且病毒分离至少 9只为阴性；对照组血清
16、 HI抗体效价的几何平均值应不高于 1:4（微量法） ，且病毒分离至少 9只为阳性。1.2.4.7 纯净 按现行中国兽药典进行检验，应无细菌、霉菌、支原体及外源病毒污染。1.2.4.8 基础种子代数 E5E15 代。1.2.4.9 毒种的保存 在-70以下保存，有效期为 60个月。1.2.5 表达鸡传染性法氏囊病病毒 VP2蛋白的埃希氏大肠杆菌基因工程菌（S-VP2 蛋白）应符合下列标准1.2.5.1 形态和生化特性 培养物涂片为革兰氏阴性短杆菌，可成短链状，在不良的培养条件下可呈现长丝状。埃希氏大肠杆菌分解葡萄糖，产生的二氧化碳和氢气大约相等；在蛋白胨肉汤中产生吲哚；在 0.5%葡萄糖肉汤中，于37 培养 4日后，培养基的 pH值低于 4.5，甲基红试验呈阳性反应；Voges
