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1、实验前准备1. 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内；2. 用酒精喷壶喷洒实验台面，打开超净台和细胞间紫外灯，照射 30min。3. 所需的培养基，PBS 等预热。4 将水浴锅预热至 37首次传代前细胞的复苏1. 打开水浴锅预热到 37，将装有细胞的冻存管从液氮中拿出，迅速置于37水浴锅，连续晃动，1 min 内迅速融化。2. 开启超净台正常工作状态（开前窗，通风，开照明灯），用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。3. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内，用酒精棉拭擦所有要进入工作台的物品。4. 600 r/min, 离心 5 min。5. 去掉上清，加入适量培养基
2、吹打均匀，传入细胞培养皿（瓶），培养瓶需要旋开瓶口少许。6. 将培养基瓶口和瓶盖消毒 2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7. 将培养皿置入 37，5% CO2 培养箱。12 小时候查看细胞状态及密度。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。在达到传代密度之前如果细胞培养基颜色由鲜红色变为红棕色或黄色，说明细胞代谢废物增多，需要更换培养基（注意，培养基颜色变黄也有可能是细胞被污染，要及时处理掉）。培养液的更换1. 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒
3、。2. 将所需的培养基（已预热）确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒 2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖 2-3 次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒 2-3次瓶口，3. 4用移液器悬空进入培养基瓶内吸取适量培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒 2-3 次后拧紧平放。4. 5 将培养基瓶口和瓶盖消毒 2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。5. 将培养瓶放于 37,5% CO2 的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天观察细胞生长情况，一般 72-96h 后，细胞生长
4、密度达到 90%，即可进行细胞的传代。细胞传代1 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。2 将所需的培养基和胰酶（已预热）确保瓶身干净后放于工作台面内，进出的 PE 管口都要用酒精棉拭擦3.旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖 2-3 次，瓶盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒 2-3 次瓶口，4用移液器悬空进入培养基瓶内吸取适量培养基再悬空移入培养瓶内，将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒 2-3 次后拧紧平放。5 将培养基瓶口和瓶盖消毒 2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸
5、等，关闭超净工作台。6. 将培养瓶放于 37,5% CO2 的培养箱内培养，旋开瓶口少许。每天定时观察细胞生长情况，一般 72-96h 后，细胞生长密度大于 90%，即可进行细胞的传代或保株（冻存）。细胞株的保存（细胞冻存）1. 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手，戴上一次性橡胶手套，用酒精消毒。2. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净后放于工作台面内，点燃酒精灯。3. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒 2-3 次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3 次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒 2-3 次瓶口，竖直放好。用移液器吸
6、取适量胰酶，悬空移入培养瓶内，使胰酶浸没整个瓶壁的细胞层，37孵育约 1 min，晃动几下培养瓶，在显微镜下观察若细胞触角消失，细胞间出现间隙并有少量细胞脱落，这时为胰酶消化的最适时机，加入含血清培养基终止消化，用移液器反复轻轻吹打 2-3 遍即可将细胞悬浮。若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度，若看不到缝隙和细胞脱落，则需继续消化。4. 将细胞悬液移入离心管离心，去掉上清后加入适量冻存液，吹打均匀后分装到冻存管（不能装满）。5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒 2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。6. 将保种管先放于 4冰箱 30min 后拿出放置-
7、20冰箱过夜，次日再放于-80的冰箱内 3-4 天，最后存放于-196的液氮灌内长期保存。此过程也可简化：步骤 5 结束后将保种管用干脱脂棉包裹后直接放于-80冰箱内过夜，放于液氮灌保存（也可以放在装有异丙醇的冻存盒，-80过夜后转到液氮）。-80冰箱冻存可保存细胞株 2-3 月。若是要用药物处理细胞，则需要按照实验目的和要求将细胞以和适的密度传到细胞培养板（6/12/24/96 wells），不同实验选用培养板不同，细胞密度也不同，处理时间长/抑制增殖类实验就稍稀一点,反之则密一点，在处理结束时细胞刚好长满最好。细胞计数（血球计数板法）计数原理：当待测细胞悬液中细胞均匀分布时，通过测定一定体
8、积悬液中的细胞的数目，即可换算出每毫升细胞悬液中细胞的细胞数目。计数板基本构造：细胞计数常使用方法 1（数四角四个大格中细胞数），细菌计数使用方法 2（数中间大格中的五个中格中细胞数）。具体操作：1. 将计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板。2. 将细胞悬液（吹打均匀）吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间，静置 3min，注意盖片下不要有气泡，也不能让悬液流入旁边槽中。3. 计算板 4 角的 4 个大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按公式计算：细胞密度=细胞数/mL=四大格细胞总数/4104稀释倍数说明：公式中除以 4，因为计数了 4 个大格的细胞数。公式中乘以 104 因为计数板中每一个大方格的体积为：1.0mm（长）1.0mm（宽）0.1mm（高）=0.1mm3=10-4ml注意：镜下偶见有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液
