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1、临床医学检验技师考试辅导 微生物检验 第 1 页第十三章细菌的生物化学试验本章考点：1.碳水化合物的代谢试验（1）糖（醇、苷）类发酵试验（2）氧化一发酵试验（OF 试验）（3）-半乳糖苷酶试验（ONPG 试验）（4）七叶苷水解试验（5）甲基红试验（6）V-P 试验2.蛋白质和氨基酸的代谢试验 （1）明胶液化试验（2）吲哚（靛基质）试验（3）硫化氢试验（4）尿素分解试验（5）苯丙氨酸脱氨酶试验（6）氨基酸脱羧酶试验3.碳源和氮源利用试验 （1）枸橼酸盐利用试验（2）丙二酸盐利用试验4.各种酶类试验 （1）氧化酶试验（2）过氧化氢酶试验（触酶试验）（3）硝酸盐还原试验（4）脂酶试验（5）卵磷脂酶试
2、验（6）DNA 酶试验（7）凝固酶试验（8）CAMP 试验（9）胆汁溶菌试验5.抑菌试验 （1）O129 抑菌试验（2）杆菌肽试验（3）奥普托欣（Optochin）试验6.复合生化试验（1）KIA 试验（2）MIU 试验不同细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力各异，其代谢的产物也不相同。这些代谢产物又各具有不同的生物化学特性，为此，可利用生物化学的方法测定这些代谢产物以鉴定细菌。在临床细菌检验工作中，除根据细菌的形态、染色、培养特性进行初步鉴定外，对绝大多数分离的未知菌的属、种鉴定，主要通过这些生物化学试验。临床医学检验技师考试辅导 微生物检验 第 2 页一、碳水化合物的代谢试验其原
3、理为：由于细菌各自具有不同的酶系统，对糖的分解能力不同，有的能分解某些糖产生酸和气体，有的虽能分解糖产生酸，但不产生气体，有的则不分解糖。据此可对分解产物进行检测从而鉴别细菌。具体试验方法有：糖类发酵试验；葡萄糖代谢类型鉴别试验；七叶苷水解试验；淀粉水解试验；甲基红试验；V-P 试验；-半乳糖苷酶试验（ONPG 试验）。1.糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：由于各种细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，故分解糖类的能力各不相同，细菌分解糖类后的终末产物亦不一致，有的产酸、产气，有的仅产酸，故可利用此特点以鉴别细菌。（2）培养基：在培养基中加入 0.5%l%的糖类（单糖、双糖或多糖）、醇类（甘露醇
4、、肌醇等）、苷类（水杨苷等）。（3）方法：将分离的纯种细菌，以无菌操作接种到糖（醇、苷）类发酵培养基中，置培养箱中培养数小时至两周后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应保持湿度，以免培养基干燥。（4）结果：接种的细菌，若能分解培养基中的糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若产气可使液体培养基中倒管内或半固体培养基内出现气泡，固体培养基内有裂隙等现象。若不分解，培养基中除有细菌生长外，无任何其他变化。（5）应用：是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要。2.氧化-发酵试验（0/F 试验）（1）原理：利用此试验可区分细菌的代谢类型。（2）培养基
5、：HL（Hugh-Leifson）培养基。（3）方法：将待检菌同时穿刺接种两支 HL 培养基，其中一支培养基滴加无菌的液体石蜡（或其他矿物油），高度不少于 lcm。将培养基于 35培养 48h 或更长。（4）结果：开管 封闭管产碱型 - -氧化型 + -发酵型 + +（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别，前者是发酵型，后者是氧化型。3.-半乳糖苷酶试验（ONPG 试验）（1）原理：临床医学检验技师考试辅导 微生物检验 第 3 页（2）试剂：0.75M ONPG 溶液。（3）方法：从克氏双糖铁培养基上取菌，
6、于 0.25ml 无菌生理盐水中制成菌悬液，加入一滴甲苯并充分振摇，使酶释放。将试管置 37水浴 5min，加入 0.25ml ONPG 试剂，水浴 20min3h 观察结果。（4）结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在 2030min 内显色。（5）应用：迅速及迟缓分解乳糖的细菌 ONPG 试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本实验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。4.七叶苷水解试验（1）原理：（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基。（3）方法：将待检菌接种于七叶苷培养基中，培养后观察结果。（4）结果：培养基变为黑色为阳性，不变色者为阴性。（5）应用：主要用于 D 群链球菌与其他链
7、球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。5.甲基红试验（1）原理： （2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，培养 24d，于培养基内加入甲基红试剂，立即观察结果。（4）结果：呈现红色为阳性；橘红色为弱阳性；黄色为阴性。（5）应用：主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌科中沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属等为阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。6.V-P 试验（1）原理：（2）培养基：葡萄糖蛋白胨水培养基。（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于 35培养 48h 后加入甲液（6%-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH 溶液
8、），振摇。（4）结果：在数分钟内出现红色为阳性；如无红色出现且于 354h 后仍如故者即为阴性。（5）应用：本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。临床医学检验技师考试辅导 微生物检验 第 4 页二、蛋白质和氨基酸的代谢试验其原理为：不同种类的细菌分解蛋白质的能力不同。细菌对蛋白质的分解，一般先由胞外酶将复杂的蛋白质分解为短肽（或氨基酸），渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。具体试验方法有：明胶液化试验；吲哚试验（靛基质试验）；硫化氢试验；尿素酶试验；苯丙氨酸脱氨酶试验；氨基酸脱羧酶试验。1.明胶液化试验（1）原理：（2）方法：将被检菌穿刺接种于明胶培养基，
9、于 22培养 7d，逐日观察结果。若用 35孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察结果前，先置 4冰箱内 30min，再看结果。（3）结果：培养基呈液化状态为阳性。（4）应用：肠杆菌科细菌的鉴别，如沙雷菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶，而其他细菌很少液化明胶。有些厌氧菌如产气荚膜梭菌、脆弱类杆菌等也能液化明胶。另外多数假单胞菌也能液化明胶。2.吲哚（靛基质）试验（1）原理：（2）培养基：蛋白胨水培养基。（3）方法：将待检菌接种于上述培养基中，于 35培养 2448h，沿试管壁慢慢加入吲哚试剂。（4）结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。（5）应用：主要用于肠杆
10、菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验（1）原理：（2）培养基：醋酸铅培养基。（3）方法：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于 35培养 2448h 观察结果。（4）结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。（5）应用：主要用于肠杆菌科中属及种的鉴别。如沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属细菌，绝大多数硫化氢阳性，其他菌属阴性。沙门菌属中也有硫化氢阴性菌种。4.尿素分解试验（1）原理：（2）培养基：尿素培养基。 （3）方法：将待检菌接种于尿素培养基，于 35培养 l824h 观察结果。临床医学检验技师考试辅导 微生物检验 第 5 页（4）结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变
11、为阴性。（5）应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。奇异变形杆菌和普通变形杆菌脲酶阳性。另外雷氏普罗威登菌和摩根菌为阳性，而斯氏和产碱普罗威登菌阴性。5.苯丙氨酸脱氨酶试验（1）原理：（2）培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。（3）方法：将被检菌浓厚接种于苯丙氨酸琼脂培养基斜面上，于 35培养 l824h，滴加 10%三氯化铁试剂 34 滴，自斜面上方流下。（4）结果：出现绿色为阳性。应立即观察结果，延长反应时问会引起褪色。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗威登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌种中其他细菌均为阴性。6.氨基酸脱羧酶试验（1）原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌
12、，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸尸胺，鸟氨酸腐胺，精氨酸精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来。（2）培养基：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基。（3）方法：将被检菌分别接种于赖氨酸（或鸟氨酸或精氨酸）培养基和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡或矿物油，于 35培养 l4d，每日观察结果。（4）结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色（指示剂为溴甲酚紫）为阳性，若测定管呈黄色为阴性。若对照管呈现紫色则试验无意义，不能作出判断。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。如沙门菌属中除伤寒和鸡沙门菌外，其余沙门菌的赖氨酸和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。志贺菌属除宋内和鲍氏志贺菌外，其他志贺菌均
13、为阴性。三、碳源和氮源利用试验是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。1.枸橼酸盐利用试验（1）原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，并且利用枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性。（2）培养基：枸橼酸盐培养基。（3）方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于 35培养 l4d，每日观察结果。（4）结果：培养基中的溴麝香草酚兰指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性；不能利用枸橼酸盐作为碳源的细菌，在此培养基上不能生长，培养基则不变色，为阴性。（5）应用：用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。在肠杆菌科中埃希菌属、志贺菌属、爱德华菌属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属、克雷伯菌属通常为阳性
14、。2.丙二酸盐利用试验（1）原理：有的细菌可利用丙二酸盐作为唯一碳源，将丙二酸盐分解生成碳酸钠，使培养基变碱。（2）培养基：丙二酸盐培养基。（3）方法：将被检菌接种于上述培养基，35培养 2448h 后观察结果。（4）结果：培养基由淡绿色变为深蓝色为阳性，颜色无变化为阴性。临床医学检验技师考试辅导 微生物检验 第 6 页（5）应用：肠杆菌科中属间及种的鉴别。克雷伯菌属为阳性，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属中有些菌种也呈阳性，其他菌属均为阴性。四、各种酶类试验1.氧化酶试验（1）原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。 （2）试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或 1%盐酸
15、二甲基对苯二胺。（3）方法：常用方法有三种；1）菌落法：直接滴加试剂于被检菌菌落上。2）滤纸法：取洁净滤纸一小块，沾取菌少许，然后加试剂。3）试剂纸片法：将滤纸片浸泡于试剂中制成试剂纸片，取菌涂于试剂纸上。（4）结果：细菌在与试剂接触 10 秒内呈深紫色，为阳性。为保证结果的准确性，分别以铜绿假单胞菌和大肠埃希菌作为阳性和阴性对照。（5）应用：主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别，前者为阴性，后者为阳性。奈瑟菌属、莫拉菌属细菌也呈阳性反应。2.过氧化氢酶试验（触酶试验）（1）原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。（2）试剂：3%过氧化氢溶液。（3）方法：取槽置于洁净的试管内或玻片上，然后加 3%过氧化氢数滴；或直接滴加 3%过氧化氢于不含血液的细菌培养物中，立即观察结果。（4）结果：有大量气泡产生者为阳性。不产生气泡者为阴性。（5）应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均产生过氧化氢酶，而链球菌属为阴性，故此试验常用于革兰阳性球菌的初步分群。
