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1、细胞内细胞因子的流式细胞仪检测一、简介随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越显的重要无比。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括：ELIspot、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞 PCR，应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及 mRNA 表达可以识别 Th1 和 Th2 细胞，此方法可获得较强的细胞内信号，但此方法工作量大、主观性强，难以进行大样本检测，且人肉眼识别能力有很大的局限性，而 ELISPOT 及单
2、细胞 PCR 技术，技术性强、劳动强度大，难以进行广泛推广。随着多标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对细胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。TH1 与 TH2(IL4，IL5，IL10)，但这些研究很难外推，因为 T 细胞克隆与体内 T 细胞功能相关性还未被揭示。早期细胞因子表达与细胞功能相关性研究是基于特定克隆细胞的激活。尽管研究应用 T 淋巴细胞克隆证明了不同细胞因子的合成，如 TH1(IL2，IFN)近来，Jung 与 Picker 采用了 monensin、PMA 等药物预孵，用 Brefeldin(BFA)、Monensin 阻
3、断了胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集，蓄积，增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。因为自然状态下，T 淋巴细胞产生少量的细胞因子，通常要对 T 淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中，T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来，胞内细胞因子信号较弱，难以进行检测。这一方法可检测单个细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。在细胞水平该方法证明了人与鼠的淋巴细胞都存在 1 型与 2 型分化，且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且这些研究清楚地证明，只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子，静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不能分泌细胞因子。胞内流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞
4、表面或胞内特定亚群标志组合，即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌，同时采用特殊的化学与抗体选择，确保静止与无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点： 快速：流式定量检测细胞内细胞因子可在一天内完成，实验流程需 6-8 小时，实际操作时间为 1-2 小时，快速简便； 简便：无需组织培养，可以全血分析，无需分离 PBMCs； 灵敏度高：高度灵敏的荧光标记与检测系统； 高效：可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型，进行多参数相关分析； 安全：减少样本处理与生物源性污染 接近生物体的分析条件：全血检测保留细胞及生化微环境更准确
5、反映了体内状况。二、所需仪器1.流式上样管及细胞培养皿或板2.25%CO2，37孵箱3. 混匀振荡器4.离心机5.加样器、Tips6.流式细胞仪三、常用的标本类型和处理方法全血：使用肝素钠抗凝的真空采血管采血，不易采用肝素锂、EDTA 和 ACD 抗凝剂，血样在 8 小时内分析，超过 8 小时会导致活性的损失，一般细胞因子阳性细胞会减少 5%。如不能在 8 小时之内检测，应将真空采血管水平室温放置。 自身血浆中外周血单个核细胞(PBMCs)：使用肝素钠抗凝的采血后，分离 PBMCs，24 小时内分析。 组织培养基中的外周血单个核细胞(PBMCs)：用 Ficoll 分离 PBMCs，将细胞重悬
6、于含 10%热灭活胎牛血清(FBS)的 RPMI1640 培养基中，调节细胞浓度为 2106细胞/ml。 细胞系与 T 细胞克隆：调节细胞浓度 2106细胞/mL 于新鲜培养基中。 冰冻全血与 PBMCs：使用 1红细胞裂解液处理活化的外周血或者 PBMCs，用 PBS 漂洗，并用含 1%的 BSA及 10%的 DMSO 的 PBS 重悬，70冻存。溶化后细胞置于染色管中，加上 23mL 的洗液，离心 5 分钟后，用破膜剂对细胞进行破膜和染色。 四、所需试剂1、细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂依据实验需要选择特殊表面标志CD45 圈定所有淋巴细胞CD3 圈定 T 淋巴细胞CD4 圈定 T 辅助
7、淋巴细胞亚群CD8 圈定 T 抑制淋巴细胞亚群CD19/或 CD20 圈定 B 淋巴细胞CD56 圈定 NK 淋巴细胞CD14 圈定单核细胞2、荧光标记的细胞因子抗体：R&D 提供 FITC、PE 和 APC 标记的细胞因子抗体3、溶血素：用外周全血检测时需使用溶血素（R&D 目录号 WL1000 用于人或者 WL2000 用于小鼠；eBioscience 目录号 00-4333）溶解红细胞4、激活剂Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)（Alexis，目录号 ALX-445-004-M001）A.DMSO 中调节浓度 0.1mg/mLB20储存。勿反复冻融.
8、分装(20l)C.每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1：100 稀释储存液D.PMA 终浓度 25ng/mL 细胞悬液 Ionomycin （Alexis,目录号 ALX-450-006-M001）A.于乙醇中配制成浓度 0.5mg/mLB.20储存C.每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1：10 稀释储存液D.细胞悬液.Ionomycin 终浓度 1g/mL Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (Sigma,Catalog No.S-4881)A.无菌无叠氮钠 PBS 调节浓度 0.5mg/mLB.4储存C.细胞悬液.SEB 终浓度 10g/mLCD3：包被在培养板
9、中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞CD28：加速不同刺激剂（包括 SEB、CD3 等）的活化效应，浓度一般为 10ug/ml5、阻断剂阻断高尔基体介导的转运作用，使得刺激细胞表达的细胞因子聚集在胞浆内 Brefeldin-A(BFA) （eBioscience，目录号 00-4506）A. 于 DMSO 中调节浓度 5mg/mLB).-20储存。勿反复冻融.分装(20 L)C. 每次实验用无菌无叠氮钠 PBS 1：10 稀释储存液D .细胞悬液.激活最后 45 小时 BFA 终浓度 10g/mL.注意：BFA 过度孵育会导致细胞活力下降 Monensin （eBioscience，
10、目录号 00-4505）6、 不含谷氨酰胺的 RPMI-16407、 固定剂：细胞在体外刺激后需要对细胞进行固定。固定的目的在于通过蛋白的交联和变性一方面使细胞因子固定在细胞内，另一方面避免细胞表面抗原丢失。含 4%的多聚甲醛 PBS 溶液（eBioscience，目录号 00-8222）8、 破膜剂：含 1皂甙、0.05叠氮化钠的 Hanks 溶液（HBBS）（eBioscience，目录号 00-8333）将细胞膜穿孔，已利于荧光标记的细胞因子抗体进入细胞内，于相应的细胞因子结合9、其它试剂：无菌无叠氮钠 PBS，乙醇，含 1%多聚甲醛的 PBS，4储存。五、细胞培养和刺激的基本方法细胞活
11、化的最终结果是产生细胞因子，根据检测指标和标本的不同，研究人员需要选择不同的刺激剂和刺激时间，以获得最佳的实验结果。下表提供了检测一些常用细胞因子的推荐的活化方法。表 1、细胞内细胞因子流式检测推荐的阳性对照活化方法检测细胞因子 阳性对照刺激方法人 IFN-g 方法 2 (4-24 小时)人 TIMP-1 方法 5人 TNF- 方法 7 (6 小时)人 IL-1a 方法 3 (6 小时)人 IL-1 方法 3 (24 小时)人 IL-2 方法 2 (4-24 小时)人 IL-4 方法 4人 IL-5 方法 1人 IL-6 单核细胞：方法 3 (6-12 小时) T 细胞：方法 6人 IL-10
12、 方法 1人 IL-12 方法 8人 IL-15 方法 3人 Fractalkine/CX3CL1 方法 1人 IL-8/CXCL8 方法 3 (24 小时)人 MCP-1/CCL2 方法 3 (24 小时)人 MIP-1a/CCL3 方法 3 (24 小时)人 MIP-1b/CCL4 方法 3 (24 小时)人 RANTES/CCL5 方法 1小鼠 IL-2 方法 9小鼠 IL-4 方法 10小鼠 IL-5 方法 10小鼠 IL-6 方法 11小鼠 IFN 方法 9 or 方法 12小鼠 TNF- 方法 9为防止细胞内细胞因子分泌到胞外，在培养的最后 4-6 个小时，需要使用蛋白转运抑制剂
13、(如 3uM monensin，10mg/ml 的 BFA)方法 1: 只使用转染细胞检测方法 2: 人的 PBMCs 使用 PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM) 刺激 4-24 小时.方法 3: 人的 PBMC 使用 LPS (0.5 - 1 ug/ml) 刺激 24 小时.方法 4: 人的 PBMCs 或者纯化的 CD4 细胞在包被人 CD3 抗体的培养板中，使用含有重组人的 IL-2（10 ng/ml，目录号 202-IL-010）和 IL-4（10 ng/ml，目录号 204-IL-005）的培养基培养两天；细胞洗涤后在含有重组人 IL-2 和 IL-4
14、的培养基中继续培养 2 天；最后收获细胞，使用 PMA (10 ng/ml) 和 Ionomycin (1 uM)刺激 6 小时方法 5: CD4+ T 细胞使用 PHA (10 ng/ml) 刺激 4 days方法 6: T 细胞使用抗 CD3 的单抗、抗 CD28 的单抗和重组人的 IL-1b (Lorre, et al., 1994, Clin Immuno Immunopath 70:1)方法 7: 使用 PMA (50 ng/ml) 和 Ionomycin (500 ng/ml)刺激(10 ng/ml) + (10 ng/ml，目录号 285-IF-100) 刺激 2 小时，然后使用
15、 IFN方法 8: PBMCs 细胞使用重组人 IFN LPS (1 ug/ml) 刺激 22 小时或者使用相同的方法刺激 THP-1 细胞.方法 9: EL4 在包被抗小鼠 CD3 抗体(25 ug/ml) 的培养板中，使用抗 CD28 抗体(2 ug/ml) + PMA (5 ng/ml) + Ionomycin (500 ng/ml) 刺激 6 小时方法 10: CD4 T 细胞在包被小鼠 CD3(25 ug/ ml)抗体的培养板中，使用含有抗小鼠的 CD28(2 ug/ml)的抗体，重组小鼠的 IL-2（10 ng/ml，目录号 402-ML-020）和 IL-4（50 ng/ml，目
16、录号 404-ML-005）的培养基培养两天；然后在含有重组小鼠 IL-2 和 IL-4 的培养基中继续培养 3 天；最后收获细胞，使用 PMA(5 ng/ml)、Ionomycin(500 ng/ml)和 monensin 刺激 6 小时。方法 11: 小鼠 ip 巨噬细胞使用 Mouse ip 1 ug/ml LPS 刺激 24 小时方法 12: 小鼠脾细胞使用 PMA (5 ng/ml)和 Ionomycin (500 ng/ml)刺激 6 小时六、流式检测细胞染色基本过程（以全血为例）1、收获细胞：肝素钠抗凝的静脉血，按 1：1 与培养基混匀，加刺激剂，同时加蛋白转运抑制剂（参照说明书）， 混匀后，37，5%二氧化碳培养 4-6 小时2、阻断 Fc 受体：用于消除非特异性的结合染色在小鼠，可使用纯化的 FcII/III 受体的抗体（CD16/32），按照 1ug/106细胞的用量，在染色缓冲液中4孵育 15 分钟，P
