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1、细菌耐药监测的临床意义与抗菌药物的合理选用,中山大学附属三院 唐英春,细菌的耐药是人类与细菌长期生存斗争的结果，从临床治疗的角度必须认识耐药的才能有的放矢，制定如何克服耐药微生物耐药的机理 1、复杂，常多重耐药。（细菌耐药机理状况,能在一定程度上反映出其本质，而细菌的耐药是复杂的，不是一成不变的，随着用药而改变，各国各地不同）,2、根据各国各地各单位监测细菌耐药状况了解分析耐药趋势，该处细菌耐药机理研究，制定用药方案，指导临床合理用药 如何避免产生耐药， 如何克服耐药， 如何选用相对敏感的药物治疗， 开发新药。,监测就是了解耐药重点必须包括主要的耐药菌：革兰阳性菌MRSA、VRE 和 DRSP
2、(PRSP)为代表。革兰阴性菌中棘手的细菌:大肠埃希菌，肺炎克雷白菌，绿脓假单胞， 不动杆菌，阴沟杆菌，嗜麦芽假单胞菌等产生超广谱-内酰胺酶）为代表多重耐药菌。,监测内容统一操作规范操作真实准确全面（苛氧菌）多点有代表性能说明目前耐药状况,监测的基本工作1、痰的收集从病人开始：教会留痰的方法新鲜标本送检(立即）合格标本的判断： 收集在灭菌容器（漱口、10%盐水气溶胶吸入）肉眼：脓性，不是口水，脓性用无菌盐水洗痰表面3次再用等量pH:7.2、2%N-乙酰半胱氨酸与一起研碎，以消化粘稠痰液 涂片革兰染色 低倍镜：上皮细胞20为合格,进行培养和菌落计数。中性粒细胞少而上皮细胞25，不合格 重新采集培
3、养注意： 须氧菌； 加5%二氧化碳；厌氧菌： 动物接种后培养的菌。 药敏：杆菌常用敏感抗菌药 球菌常用抗菌药 要有标准菌株对照,2、血培养：疑败血症者治疗前多次；感染性心内膜炎、伤寒、动脉内膜炎、布氏杆菌病菌血症持续存在24小时内每隔1小时采血1次；其他感染的菌血症可在寒战高热时采血并24-48小时内分别采血3次，每次血量不少于10毫升（婴儿、儿童5毫升）最好床边立即培养,培养基：根据不同目的采用不同 如血培养基,巧克力培养基,M-H培养基等，特殊培养基，选择性培养基。,有意义病原微生物的确定： 痰：争议较大 107CFU/ml为病原菌 104 107CFU/ml可能为病原菌，需结合涂片和培养
4、的结果 104CFU/ml提示为污染均 真菌：三次同一菌阳性有菌丝，特殊染色,微生物学检查细菌培养规范化：送检标本合格合理运送，定量培养药敏试验（作那些药敏，标准等严格使用NCCLS规定）纸片法，MIC 法 E-test法如何判断结果？,监测细菌耐药的表现： 药效和耐药是同时产生的，了解耐药才能有针对性地遏制耐药，而正确的监测方法是准确的合理方案 MIC是药物体外抗菌活性的表现 MIC值上升或高峰后移是药物体外抗菌活性下降、下降到一定的值就成为耐药,简单提提耐药1、耐药金葡菌MRSA 携带mecA基因,MSSA attB ccrA,B mecRI mecAType1 ccrA,B Tn554
5、mecI mecRI mecA Type2 ccrA,B Tn554 mecI mecRI mecAType3 Hg Tc,Tc:对四环素耐药，Hg:对水银耐药的转座子Tn554带有对红霉素耐药，并载有插入型质粒pUB110耐氨基糖甙类的转座子,Type1是1960年在英国最早发现的MRSANCCLS10442株Type2是pre-MRSA 的N315株Type3是1980年以欧洲为中心世界广为流行的MRSA的一种，从新西兰分离的85/2082株,有mecA基因不表现耐药，80年代已发现金葡菌中存在有带mecA基因而并不对甲氧西林耐药株，对此称为前MRSA，对mecA基因上游进行调查分析，发现
6、在其上游存在控制mecA 基因活动的mecI mecRI基因。证实了mecI基因有控制mecA基因作用。,这些调节基因变异或缺失有重要意义。实验除去这些调控基因形成了耐药性和PBP2的表达，证实了mecI基因有控制mecA基因作用。近年来研究DNA水平的分型与多重耐药之间有一定的联系，其原因是其耐药株引起的感染不易控制而成为流行株（(EMRSA). mecI mecRI有吸引其他耐药决定因子整合到mec基因片段中。,葡萄球菌也可产生-内酰胺酶。金葡菌存在多种外排泵系统，已有很多报告。MRSA存在qacB qacJ Smr等多种主动外排系统其在多重耐药中起重要作用。,金葡菌可产生细菌生物膜，可形
7、成被膜病生物膜使很多药物不能进入细菌内，而不能发挥抗菌作用，因其代谢等变态反应成被膜病致使细菌可以长期在病灶潜伏，不被吞噬细胞作用。因某种原因细菌从膜内移出则发病,可成为游离菌使病灶再感染,耐大环内酯类，大环内酯类对细菌的作用是通过与核糖体结合抑制细菌蛋白质的合成，细菌核糖体由大亚基（50S）和小亚基（30S ）构成，当位于50S亚单位的23SrRNA的腺嘌呤甲基化时，药物不能与之结合而耐药，,葡萄球菌属耐大环内酯类抗菌药物的耐药基因erm(erythromycin resistance methylase)（已发现至少有8类），其中常见的ermA ，ermC基因为葡萄球菌属耐药基因，对大环内
8、酯类耐药，这些基因位于质粒和染色体上，引起交叉耐药。又因大环内酯类，林可霉素以及链阳菌素作用部位相似，三类药物常同时耐药，称谓MLS耐药，治疗时要注意药物选择。,2、肺炎链球菌,亚洲地区ANSORP(Asian Network for Surveillance of Resistant Pathogens) 报道PRSP越南90% ，斯里兰卡85%， 韩国65%，香港68% ，台湾63%，泰国53 8% 。,2001年上海地区耐青霉素肺炎链球菌儿童组分离率82.8%其中中耐48.2 9% ，高耐14.6%成人组为13.6%，均属高耐。2002年为41. 8% PISP 和 PRSP分别为39
9、.8%和12. 0%，2003年62 .8% PISP升至48. 2% PRSP14. 6%，明显升高。（成人较低13. 6%）。2002年北京地区：PISP儿童分离率46. 4%。北京地区20022003 PRSP年呼吸道病原菌耐药检测PISP23.9% PRSP22.7%,这些菌同时耐红霉素等大环内酯类抗生素、克林霉素、及复方磺胺异恶唑等,肺炎链球菌耐药机理,对青霉素耐药PRSP或 PRSP(penicillin resistant Streptococcus pneumoniae )链球菌有6种青霉素结合蛋白PBPs,PBP1a、 1b、 2a、 2b、 2x、 PBP3。PRSP中1b
10、、 2a、 2b、 2x对-内酰胺类抗生素亲和力下降，不能与之结合，即不能阻碍细菌细胞壁的合成而耐药。高分子量蛋白有PBP1a、 1b 2a、 2b 、2x。其中2b和2x是其-内酰胺类抗生素耐药的决定因子、,对-内酰胺类不同程度的耐药，2x变异可致头孢塞肟耐药。2b不与广谱头孢类作用，无耐药作用，低分子量蛋白PBP3，亲和力下降可致高水平耐药。,低亲和力PBP由突变的pbp基因编码，来自草绿链球菌，缓症链球菌同源基因序列，通过种间重组产生镶嵌结构，可以发生在不同位点，造成了PBP变异的多样性，其耐药在链球菌种之间可广泛水平及垂直传播。,来 源、变 异 基 因（1025 核 苷 酸 序 列 与
11、 敏 感 株不 同）各 种 链 球 菌 外 源 基 因 敏感株 PBP 结构基因片段重组 变 异 基 因（镶 嵌 结 构） 多 种 位 点 S.P 以 多 种 方 式 改 变 PBP来 源：多 样重 组 位 点：多 样，可 水 平 传 播，可 纵 向 传 播,对大环内酯类耐药靶位改变：大环内酯类与细菌核糖体50S亚基形成复合物，特异地抑制细菌蛋白质合成而发挥作用。耐大环内酯类肺炎链球菌可产生核糖体甲基化酶（ErmB）使23SrRNA的特定腺嘌呤甲基化而阻断药物和核糖体结合而耐药。核糖体甲基化酶由耐药基因erm(erythromycin resistance methylase) 编码，（已发现
12、至少有8类），,其中常见的ermA ermC基因为葡萄球菌属耐药基因，ermB为肺炎链球菌耐药基因而对大环内酯类耐药，这些基因位于质粒和染色体上，一般位于结合转座子Tn1545上，引起交叉耐药。又因大环内酯类，林可霉素以及链阳菌素B作用部位相似，三类药物常同时耐药，称谓MLS耐药，治疗时要注意药物选择,MLS耐药性分为内在型(cMLS)和(诱导型(iMLS) ermB基因上游调控区决定其型的表达，一旦耐药ermB基因完全被诱导产生对所有大环内酯类，林可霉素以及链阳菌素B高水平耐药。不同国家耐药流行不同，意大利，西班牙，比利时其耐药以靶位改变多见。,主动外排系统：葡萄球菌，链球菌存在主动外排系统
13、，最近报道肺炎链球菌有一种新的耐药表型，对14、15元环大环内酯类低水平耐药，对16元环大环内酯类、克林霉素、链阳菌素B敏感 ，为M型，其耐药是外排编码基因mefA决定的，mefA依靠质子运动力泵出14、15元环大环内酯类抗生素。,对喹诺酮类耐药 靶位改变：喹诺酮类耐药是型拓扑异构酶即DNA促旋酶和拓扑异构酶，前者是由gyrA编码的两个 GyrA亚基和 gyrB编码的两个GyrB亚基组成的四聚体，后者是由 parC编码的两个ParC亚基和 parE编码的两个 ParE亚基组成的四聚体。细菌的gyrA和/或parC一段核苷酸序列与喹诺酮耐药密切相关，是其耐药决定区，DNA促旋酶和拓扑异构酶是细菌
14、生长必须的酶，,肺炎链球菌对喹诺酮类耐药主要是DNA促旋酶和拓扑异构酶的一个或多个基因突变，导致相应氨基酸替代使药物不能与靶位结合。高水平耐药的表达须parC和gyrA双位点突变。不同基因突变表现出对不同喹诺酮类药耐药，诺氟沙星，环丙沙星，左氧氟沙星等主要作用靶位是拓扑异构酶，司帕沙星，莫西沙星，加替沙星等主要作用靶位是DNA促旋酶。,主动外排系统：Branwald研究表明45.4%对诺氟沙星，环丙沙星敏感性下降的肺炎球菌临床分离株显示了外排表型，所有外排表型的临床分离株和突变株对疏水性喹诺酮类耐药如司帕沙星，莫西沙星敏感。外排基因pmrA编码一个由399个氨基酸组成的蛋白质PmrA,与金葡菌，枯草芽孢杆菌外排蛋白有较高的同源性。,对其他药物耐药磺胺类：耐磺胺类肺炎球菌二氢叶酸合成酶编码基因silA突变导致耐药。氯霉素：耐药肺炎链球菌使氯霉素乙酰化而是去活性，结合转座子Tn5253携带了耐邀基因盒，Tn5253是复合转座子，由四环素耐药转座子Tn5251和一个氯霉素耐药的转座子Tn5252组成。肺炎链球菌无耐药质粒，耐氯霉素肺炎链球菌与金葡菌的质粒pc194的基因盒完全一致，由金葡菌的质粒pc194整合到肺炎球菌染色体导致耐氯霉素。,
