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1、流式细胞术的样品制备,FCM的样品制备包括单分散细胞悬液制备技术，细胞生物学特征标记技术及荧光染色技术，FCM是对细胞或细胞器的结构和某些功能进行定量测定，并可以根据细胞亚群的特点性质对其进行分类的技术。FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的悬液，在FCM技术中制备出合格的单细胞悬液是非常重要的环节，这些单细胞悬液主要来源于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石蜡包埋组织等。,一、单层培养细胞分散为单个细胞 贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备操作步骤：1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有
2、10%胎牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4冰箱中。,（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备操作步骤：1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常规固定液为70%乙醇，然后保存于4冰箱中。,二、实体组织单分散细胞的制备 新鲜实体组织 新鲜实体组织是手术或活检后根据检测目的而采取的样品，此样品应及时进行适当的保存处理，如及
3、时用固定剂或低温对组织进行保存，以避免由于室温过高、放置时间过长而造成组织自溶，影响检测结果。,新鲜实体组织单细胞悬液制备方法如下： 酶消化法 机械法 剪碎法 网搓法 研磨法 化学试剂处理法,酶消化法 酶对实体组织分散作用原理主要有三方面： 一是可以破坏组织间的胶原。 二是可以水解组织细胞的紧密连结装置的蛋白性物质。 三是可以水解组织间的粘多糖物质。 酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用的酶类试剂有： 蛋白酶类，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞； 胰酶，能水解脂键和肽键； 胶原酶，能降解几种分子类型的胶原； 溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键
4、； 弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。,为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的选择和影响因素： 酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成 酶效价降低 注意组织在消化液中的消化时间 注意酶活性的PH值 注意酶的适用浓度 随时注意影响酶活性的其他因素 各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的，不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的结构或功能产生不利的影响。
5、,酶学方法的一般程序：将适合于酶消化的组织置于离心管中。将选好的酶溶液1-2ml加入盛有被消化组织的试管中。一般消化20-30分钟(恒温37C或室温)，消化期间要间接振荡或吹打。终止消化，收集细胞悬液，以尼龙网(200目)过滤，除去大团块，以低速离心除去细胞碎片。将制备好的单细胞进行流式细胞术分析或保存。,机械法 机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注射针头抽吸细胞以分散细胞，采用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易造成细胞悬液中细胞碎片，所以机械法常与其他方法配合使用。,常用的几种机械法制备过程如下：剪碎法：将组织块放入平皿中，加入少量的盐水。用剪刀将
6、组织剪至匀浆状。加入10ml生理盐水。用吸管吸取组织匀浆，先以100目尼龙网过滤到试管中。离心沉淀1000prm3-5分钟，再用生理盐水洗三次，每次以短时低速离心沉淀(500-800prm)去除细胞碎片。以300目尼龙网过滤除去细胞团块。70%冰乙醇固定，放入4冰箱。,网搓法：将100目铜网扎在小烧杯上。把剪碎的组织放在网上，以眼科镊子轻轻搓组织块，边搓边用生理盐水冲洗，直到将组织搓完。用300目的尼龙网过滤细胞悬液除去大的团块收集细胞悬液，离心沉淀1000prm，5分钟。 70%乙醇固定，置4冰箱备用。,研磨法准备一只70ml组织研磨器将组织剪碎至小块。放入组织研磨器中，加入1-2ml生理盐
7、水。转动研棒，研至匀浆即可。加入生理盐水10-20ml，冲洗研器。收集细胞悬液，并经300目尼龙网过滤，离心沉淀500-800prm，1-2分钟，再用生理盐水洗三次，离心沉淀。,化学试剂处理法 化学试剂处理法的主要原理是将细胞间起粘连作用 的钙镁离子置换出来，从而使细胞分散下来。 试剂配制： 0.2%EDTA配制 EDTA0.2g溶解后，加入Hanks液100ml，封装高压消毒，置0-4保存。 胰酶加EDTA配制 胰酶0.25g+PBS(PH7.0)200ml，浓度0.125%，EDTA0.2g+PBS(PH7.0)200ml，浓度0.2%。 各取40ml混合，分装置冰箱保存，用时过滤既可。,
8、实验步骤：将组织切成薄片放入试管。加入EDTA液5ml，室温，半小时，弃之。加入胰酶+EDTA液5-10ml，在37恒温水浴30分钟，间断振荡3-5次。用300目尼龙网过滤，离心沉淀1000prm，5分钟，再以生理盐水洗2-3次，离心500-800prm，1-2分钟。70%乙醇固定置冰箱中被检。,实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果，需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较
9、理想的，但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法，才能获得理想的样品和更好的FCM结果。,注意事项：新鲜组织标本应及时进行保存，以免组织在室温下放置时间过长，造成细胞自溶导致DNA降解，影响FCM测定结果。根据实验目的选用最佳的细胞固定方法，以免由于固定剂的原因，造成FCM检测结果的不稳定。酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH值、浓度等方面对酶消化法的影响。需注意不同的组织选用适当的方法，如富于细胞的肿瘤(淋巴瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化癌、髓样癌以及一些软组织肉瘤)不一定要用酶学或化学法，往往用单独的机械法就可以收到大量
10、单分散细胞。在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤，如食管癌、乳癌、皮肤癌等，用胶原酶为好，因为胶原酶具有在Ca2、Mg 2存在或在血清状态下不发生活性降低的特征。,实验方法：石蜡包埋组织在切片机上切取40-50m厚的组织片3-5片。将切取的组织片放入试管中。加入二甲苯5-8ml脱蜡(在室温下)，1-2天，视石蜡脱净与否，可更换一次二甲苯，蜡脱净后弃去二甲苯。水化：依次加入100%、95%、70%、50%梯度的酒精5ml，每步10分钟，去乙醇，加入蒸馏水3-5ml，10分钟后弃之。消化：加入2ml 0.5%胃蛋白酶(pH值1.5-2.0)置37恒温水浴中消化30分钟，消化期
11、间每隔10分钟振荡一次。,石蜡包埋组织单细胞悬液的制备,消化30分钟后，立即加入生理盐水终止消化。经300目尼龙网过滤，未消化完的组织片可以二次消化。收集细胞悬液，离心沉淀1500prm，以生理盐水漂洗1-2次，离心沉淀1500prm，再以生理盐水漂洗1-2次，离心沉淀500-800prm，去碎片。制备好的单细胞悬液作涂片，AO染色在荧光显微镜下观察，应为完整细胞核，核发出黄绿色荧光。单细胞样品1106细胞/ml，加入荧光染液溴化乙啶(EB)或碘化丙啶(PI)1ml，置0-4冰箱30分钟，经300目尼龙网过滤后上机检测。,注意事项：一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡脱净的方法是，弃去二甲
12、苯，加入100%乙醇，如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则没有脱净。消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞核被消化掉。切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间过长，一般以40-50m为宜。,二、血液单细胞样品的制备 血液是天然的单细胞分散细胞悬液，血中的细胞成分在生理状态下呈分散的游离状态，它是流式细胞分析的最合适的样品，全血中含有红细胞，白细胞和血小板三种有形成分，但流式细胞的检测是以某一群细胞为测定对象，因此在检测前须将所测的某群细胞分离出来，下面分别介绍几种血细胞的分离制备方法。, 淋巴细胞的制备取肝素抗凝血2.0ml，用生理盐水2ml将全血
13、稀释至4ml。先将3ml人淋巴细胞分离液放入另一个离心管，然后将稀释后的血沿试管内壁缓缓加入到分离液面之上，勿用力过大，以免造成血液与分离液混合，保持清晰的分层状态。离心2000prm，30分钟，室温18-20，离心后可见试管内的血液清楚的分为4层，上层为血浆层，中层为分离液层(淋巴细胞所处的位置在血浆层与分离液层中间)，底层为红细胞，红细胞上为粒细胞。用吸管将上层与中层之间的淋巴细胞吸出，收集到另一支离心管，用生理盐水稀释至10ml，离心洗涤2次，每次均以1500prm, 10分钟，弃上清后即得到纯度较高的淋巴细胞，但可有少量的单核细胞。70%冰乙醇固定，置4冰箱保存。, 粒细胞的制备用淋巴
14、细胞分离液对细胞进行分层。粒细胞的比重较淋巴细胞稍大，因此经分离液分离后的粒细胞，分层于红细胞之上，分离液的底部。以吸管慢慢将粒细胞层吸出，置另一支离心管内，以5ml的Hanks液洗涤三次，每次离心沉淀1500prm，10分钟。在吸取粒细胞的同时常附带一些红细胞，因此需将红细胞去除，加入1.0ml低渗溶液，30-40秒。再以Hanks液洗涤2次，即可获得纯度大于95%以上的粒细胞。, 单核细胞制备1. 取肝素1000u/ml抗凝全血3.0m1,加入3.0ml生理 盐水将血稀释,均在无菌条件下操作。2.1640培养液10.0ml,放入培养瓶内,将稀释血加入 培养液中,混匀,与培养瓶接触面要大。3
15、.放入37恒温箱内孵育30-40分钟,取出培养瓶 ,将血倾倒掉,用生理盐水将培养瓶轻轻冲洗一次,以去掉残留的血液,这时培养瓶壁上贴附了大量的单核细胞,因为单核细胞具有短时培养期内贴附快的特点 ,而其他细胞没有这个特性,所以利用这一特性进行短时培养可获得较纯的单核细胞。,4.将粘附于培养瓶壁上的单核细胞消化下来,用0.25%胰酶消化1015分钟,室温下,并不断摇震,以促使细胞脱落下,单核细胞的粘附力很强,用酶消化往往获得细胞数少,目前亦采用机械的方法,用一橡皮刷,伸入培养瓶在瓶壁上轻擦,将细胞刮取下,但切勿用力过大,造成细胞损伤过多。5.脱落下来的细胞移入离心管,离心沉淀1500prm,5分钟,
16、再以生理盐水漂洗23 次,每次离心800prm,2分钟,以去除碎片杂质。6.将细胞涂片,以丫啶橙染色,置荧光显微镜下观察形态和纯度。7.将细胞以70%乙醇固定,置0-4冰箱保存备检。,三、脱落细胞单细胞悬液的制备 在临床实际工作中，可收集到大量自然脱落的细胞，这些细胞标本经过简单的处理，就可得到较好的单分散细胞悬液，所以是流式细胞术检测的天然样品，下面介绍几种常见的脱落细胞样品制备方法。 宫颈脱落细胞悬液的制备1.首先用生理盐水冲洗宫颈表面的分泌物,以海棉轻拭宫颈表面,将海棉中吸附的脱落细胞洗脱到20ml生理盐水中。2.收集细胞悬液,以1500prm离心沉淀,用生理盐水洗涤2次,每次5分钟,弃上清后加入70%乙醇3ml固定备检。,
