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1、项目名称： 重要病毒持续性感染形成和维持的分子机制研究首席科学家： 袁正宏 复旦大学起止年限： 2012.1-2016.8依托部门： 教育部 上海市科委 卫生部一、关键科学问题及研究内容本项目以 HBV 和 HIV 为主要研究对象，并在部分环节上以疱疹病毒的成熟研究体系为参照，从靶细胞和机体两个水平探索病毒持续性感染形成和维持的机制。靶细胞水平选择的关键环节包括病毒入侵细胞、病毒复制的调控和病毒拮抗细胞凋亡；机体水平选择的关键环节为病毒诱导的免疫耐受和免疫功能损伤。这些环节基本上是所有持续性感染的病毒在形成和维持持续性感染过程中所必须经历的。通过深入研究，在揭示这些病毒形成和维持持续性感染的特
2、性的同时，争取发现它们之间的共性，为 HBV 和 HIV 等病毒持续性感染的防治提供特异性和广谱性的干预靶点。主要研究内容:针对上述关键科学问题，拟开展以下研究：（一）HBV 和 HIV 等与靶细胞相互作用形成和维持持续性感染的机制1. HBV 和 HIV 入侵靶细胞的机制：1) 利用感染细胞模型与原代肝细胞培养体系，研究 HBV 吸附肝细胞过程中病毒表面蛋白与细胞表面分子相互作用及介导病毒入侵的机制；2) 利用病毒内吞和膜融合的细胞模型，研究影响 HBV 和 HIV 表面蛋白介导的病毒内吞和膜融合的因素，探寻参与病毒内吞过程的细胞分子并研究它们与病毒表面蛋白的相互作用；3) 利用肠道粘膜活组
3、织模型，探索 HIV 跨越粘膜屏障及在细胞间传递（感染突触）的机制，研究感染微环境中各种因素（如病毒的存在形式、趋化因子等）对感染过程的影响。2. 持续性感染中病毒复制的调控机制：1) 研究 HBV 表面蛋白调控 cccDNA 形成的分子机理，研究临床常见 HBV 准种的表面蛋白在调控 cccDNA 形成中的功能差异及与临床疾病进展的关系；2) 研究 HIV-1 感染靶细胞后，病毒蛋白或基因通过与宿主细胞内元件的相互作用，抑制免疫信号传递的分子机制；3) 研究 HBV 影响细胞自噬的分子机理及对病毒复制的影响；4) 比较 HBV 和疱疹病毒在调控自噬作用机制上的异同，发现共同的关键节点分子。3
4、. 持续性感染病毒拮抗细胞凋亡的机制：1) 研究和确定 HBV 和疱疹病毒抑制细胞凋亡的主要通路（如死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路或细胞周期检验点等） ；2) 鉴定抑制细胞凋亡的病毒因子，分析其抑制机制及相互作用的关键宿主蛋白；3) 比较不同病毒在持续性感染状态下拮抗细胞凋亡的共性。（二）HBV 和 HIV 等与免疫系统相互作用形成和维持持续性感染的机制4. 病毒持续性感染诱导免疫耐受的机制及逆转策略1) 研究 HBV 及其病毒成分抑制天然免疫系统（包括肝细胞、树突状细胞及NK 细胞等）的识别能力、细胞活化及其免疫网络调节功能等，阐述 HBV诱导天然免疫耐受的分子机制；2) 研究 HBV
5、 和 HIV 在微环境中分别在 Kuffer 细胞和 DC 细胞的介导下诱导Treg 导致获得性免疫耐受的机制。3) 利用基因敲除、RNAi 等技术及调控天然免疫的新型制剂等手段达到抑制病毒复制、切断耐受相关通路、调节 Treg 等目标，并评估上述手段对免疫功能的影响，探索可能的免疫耐受逆转策略。5. 病毒持续性感染诱导免疫功能损伤的机制及修复策略：1）固有免疫细胞功能损伤的分子机制：利用 HBV 与 HIV-1 感染者标本，研究APC 细胞与 NK 细胞的表面活化与抑制受体表达、细胞因子分泌、T 细胞活化与调节等功能的变化。利用细胞模型与转基因动物模型观察 APC 免疫功能的损伤及损伤对获得
6、性免疫细胞的影响。2） T 细胞功能损伤的分子机制：利用感染患者，系统观察不同病程来源 T 免疫细胞的功能损伤情况，包括 T 细胞功能减少或缺陷、抑制 T 细胞功能的负向调控与激活调控严重失衡等。3). 病毒感染免疫功能损伤的修复策略研究。利用细胞模型与转基因动物等模型再现病毒感染引起的免疫功能损伤，并利用基因敲除或 RNAi 技术，探索利用基因敲除、RNAi 或抗体阻断技术，探讨修复损伤的可能机制与修复策略。同时探索抑制免疫系统过度激活降低免疫损伤的策略，观察降低病毒复制、切断抑制通路、提供生长因子等手段对免疫细胞功能与亚群恢复的可能性。二、预期目标总体目标：本项目根据国家重大传染病防治中基
7、础研究的战略需求和国际研究前沿，聚焦于病毒持续性感染形成和维持的关键环节与共性科学问题，选择HBV、 HIV 为主要研究对象，部分参照疱疹病毒的成熟研究体系，运用前沿组学、分子病毒学、分子免疫学与生物信息学等先进技术，深入研究和揭示病毒形成和维持持续性感染过程中病毒入侵靶细胞、病毒复制的调控、病毒拮抗细胞凋亡及逃避免疫清除等关键环节的分子机制，为研究阻断 HBV 和 HIV 等病毒持续性感染的策略，防治相关重大传染病提供科学依据和技术支撑。通过项目的实施，将培养一批在病毒学研究领域国际创新型拔尖人才和学术骨干，形成具有较强国际竞争力的研究团队，推动我国在病毒持续性感染领域的研究达到国际先进水平
8、。五年预期目标：1. 揭示 HBV 和 HIV 表面蛋白与细胞分子相互作用所介导的受体特异性与非特异性病毒进入靶细胞的机制。初步阐明 HIV 跨越粘膜屏障及在首感细胞与终末靶细胞之间传递的机制。2. 揭示 HBVcccDNA 形成机制及表面蛋白调控病毒复制的机理及 HIV-1 感染宿主细胞后如何逃避免疫系统监视而导致持续性感染的分子机制。阐明HBV 和疱疹病毒调控细胞自噬以利于病毒复制的分子机制，发现共性的关键分子。3. 阐明 HBV 等病毒持续性感染过程中病毒因子与宿主蛋白相互作用，协同调控宿主细胞凋亡的分子机制，发现关键的共性信号通路和分子。4. 阐明 HBV 基因组中所含的 ODN 和病
9、毒蛋白因子诱导固有免疫耐受的机制；揭示 HBV 和 HIV 蛋白分别通过枯否氏细胞和 DC 细胞诱导 Treg 产生的机制。5. 揭示 HBV 和 HIV 持续性感染中固有免疫系统、T 细胞免疫功能损伤的机制；力争获得 1-2 个具有应用潜力的修复策略，为乙型肝炎与艾滋病的免疫干预与治疗性疫苗的研制奠定理论基础。6. 培养 1-3 名在病毒学研究领域具有较高国际声望的创新型拔尖人才，培养20 人以上中青年学术骨干，形成具有较强国际竞争力的病毒持续性感染研究团队，争取建立融合分子病毒学、分子免疫学和病毒控制策略研究的国家级科研基地。7. 发表 50-70 篇 SCI 研究论文，其中影响因子 10
10、 以上的论文 2-3 篇，影响因子 5 以上的论文 10-15 篇，争取在 Nature、Science 等国际著名综合性学术刊物发表研究成果。8. 申请 5 项以上中国发明专利。三、研究方案学术思路：本项目根据我国重大传染病防控对基础研究的实际需求和国际研究前沿，围绕病毒持续性感染的形成和维持机制这个传染病和免疫学基础研究中的核心科学问题，以 HBV（DNA/RNA 病毒）与 HIV（RNA 病毒）为主要研究对象，在部分环节上利用疱疹病毒（DNA 病毒）的成熟体系为参照对象，运用前沿组学、分子病毒学、分子免疫学与生物信息学等学科的先进技术，从靶细胞和机体两个层面选择与病毒形成和维持持续性感染
11、密切相关的若干关键环节：病毒入侵细胞、病毒复制的调控、病毒拮抗细胞凋亡以及诱导免疫耐受和免疫功能损伤，通过不同水平的研究模型系统研究病毒与宿主分子的相互作用，对比不同病毒形成和维持持续性感染的机制，力争发现其共性，从而不仅获得对 HBV和 HIV 形成和维持持续性感染机制的新认识，而且为其它病毒持续性感染的研究提供启示，为干预 HBV 和 HIV 等的持续性感染提供特异的和共性的靶点。技术途径：本项目利用细胞组织模型、动物模型及临床标本，应用基因组学、蛋白质组学、分子生物学、分子免疫学、转基因与基因敲除及 RNA 干扰等技术，系统研究 HBV 和 HIV 持续性感染形成和维持的机制，并在此基础
12、上，利用 RNA干扰、抗体阻断等技术探索阻断这些病毒持续性感染的策略。项目的技术路线如下图所示。项目技术路线示意图创新性和特色：本项目以 HBV、HIV 等持续性感染的形成和维持机制为研究内容，开展系统研究，具有很强的创新性，主要体现在以下几方面。虽然不同病毒的持续性感染过程各有特点，但它们都必须与同一个人体系统的细胞和分子相互作用，因此，不同病毒的持续性感染过程中不可避免地存在一些共同或相似的性质，发现这些共性对于遏制病毒的持续性感染有极重大的意义。理论上，针对这些共性的防治策略有可能控制多种病毒的持续性感染。研究不同病毒的持续性感染的共性也是国际上传染病学和免疫学研究的最新生长点，所以，本
13、项目在着眼于研究 HBV 和 HIV 等持续性感染的特点的同时，注重比较它们之间的异同，以求发现这些病毒持续性感染形成和维持的共性机制。本项目选择的关键环节包括病毒入侵细胞、复制调控、抗凋亡以及诱导免疫耐受和免疫功能损伤等，是病毒持续性感染形成和维持过程中不可分割的有机组成部分，将这些关键环节纳入同一个项目进行研究，相对于分别就某一个环节进行的研究而言，更有系统性，也更能反映持续性感染形成和维持的整体面貌。本项目的许多研究内容如 HBV 入侵细胞的机制、HIV 跨越粘膜屏障的机理、病毒通过影响自噬而调控病毒复制、不同病毒抗凋亡机制的比较研究、病毒在持续性感染中诱导免疫耐受或免疫功能损伤机制等都
14、是本领域的重大问题或热点问题。这些重大或热点问题的突破将开辟相关病毒研究领域的新发展方向，可能直接促进新的病毒感染细胞模型和疾病动物模型的产生，从而极大地推动领域发展。而首先在这些问题上取得突破的研究力量显然将在相关领域中取得优势地位，从而使我国在病毒持续性感染研究方面达到国际先进的水平。本项目拟与国际上本领域的先进实验室（加拿大 Alberta 大学李嘉诚研究所）通过大型项目的联合资助，探索一条我国与他国间科学研究合作的新途径，实现人员和信息充分交流，资源和技术密切互补，合理分工，加快研究进度，齐心协力攻克科学难题。可行性分析：1. 理论上可行：本研究所涉及病毒与宿主细胞和分子的相互作用包括
15、病毒表面蛋白介导病毒入侵细胞、病毒在细胞间的传递、维持持续性感染状态时病毒复制调控与再激活、病毒抵抗宿主细胞凋亡以及通过诱导免疫耐受与免疫损伤逃避或压制宿主免疫系统攻击等研究内容均基于国际相关领域的最新进展以及课题组长期的研究积累，有成功经验可循，部分研究已经取得初步成果。2. 具有资源优势：项目团队由从事基础研究、临床研究以及动物模型研究的实验室构成，可保障研究工作获得必要的细胞模型、动物模型和临床标本等资源。其中主要承担单位之一复旦大学拥有多种 HBV 转基因小鼠模型，拥有 HIV 病毒株与伪病毒毒株近 50 株。3. 具有成熟的技术平台：项目团队中的复旦大学与中科院院所已具备国际标准的基
16、因组学、功能基因组学、蛋白质组学和生物信息学研发平台。项目团队已建立了转基因小鼠与灵长类动物平台，并具备生物安全二级与三级实验室等保障条件，为研究计划的实施奠定了物质基础。各课题组熟练掌握了进行毒力评价研究的多种方法和模型，所需其它各类实验技术均已被研究团队熟练掌握，开展本研究不存在技术障碍。4. 具有高素质的研究团队：本项目集合了来自多个国家和省部级重点实验室、大多具有海外高水平实验室研究经历的中青年科学家为主体的研究团队，包括国家“ ”引进人才 1 人、中科院“百人计划”引进人才 3 人、 “国家杰出青年基金” 获得者 2 人、省部级“ 杰出青年基金获得者 ”以及地方学科带头人与领军人才多名。集中了乙型肝炎、艾滋病以及疱疹病毒领域的高水平实验室，具有良好的工作基础，为本项目的完成提供了重要保障。课题设置思路：本项目紧紧围绕病毒形成和维持持续性感染的机制这个传染病基础研究中的核心科学问题，以我国当前最重要的持续性感染的病毒HBV（DNA/RNA 病毒）与 HIV（RNA 病毒）为
