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1、电子显微镜技术在病理学的应用敖平星，高 洪*(云南农业大学动物科技学院，云南 昆明，650201)摘 要 电子显 微镜技术在病理学研究中正发挥着重要作用。它使病理学研究进入到了超微结构水平。本文分别探讨 了免疫电镜、透射 电镜、扫描电镜技术在病理学中应用及其发展的前景与趋势。关建词 免疫电镜；透射电镜；扫描电镀；病理学病理学是研究疾病的病因、发病机理及患病机体在疾病发生发展过程中的形态结构和功能改变，阐明其本质，从而为认识和掌握疾病发生发展的规律，为防治疾病提供必要的理论基础。早在 19 世纪中叶，德国物理学家魏尔啸（R.virchon,18211902）在显微镜的帮助下，通过病变组织细胞的深
2、入观察，首创了细胞病理学（cellular pathology） 。他认为细胞的结构改变和细胞的功能障碍是一切疾病的基础，并指出形态学改变与疾病过程和临床表现的关系。 随着这现代科学技术的发展，电子显微镜也日趋进步。自从 1590 年复式光学显微镜发明以后，生物微细构造的神秘面纱就逐渐的被揭开了。 但至今光学显微镜的解像力由于可见光波长的特性，无法突破 0.2 微米的极限，而事实上光学显微镜理论上的解像极限也仅有 0.172 微米。在这种解像力下，大部分细胞器的详细构造是无法被看清楚的，为了寻求具有更佳解像的显微镜，科学家们终于在 1930 年发明了电子显微镜，突破了光学显微镜的极限，使许多更
3、细微的细胞器、病毒甚至 DNA 的分子构造呈现在人们的眼前。在过去半个世纪中，电子显微镜蓬勃而成功的应用在许多生物医学方面的研究，诸如 AlbertClaude和 GeorgePalade 因其卓越的光学显微镜研究的成果而获得 1974 年的诺贝尔奖。电子显微镜技术作为观察物质超微结构的一种手段 1。一定的疾病具有一定的病因、临床表现和相应的形态结构的改变，运用免疫、透视及扫描电子显微镜对组织、细胞的内部和表面超微结构进行观察，在超微结构水平上，常可将形态结构的改变与机能代谢变化有机地联系起来。这使得我们对错综复杂的疾病现象获得日益深入的认识和理解，也使病理学诊断和研究进一步越出单纯形态描述的
4、窠臼。如今，随着当今科学技术的发展特别是显微医学的发展，免疫电镜、透射电镜及扫描电镜技术被广泛应用于病理学的形态学研究、实验研究和临床诊断 2。该技术更成为病理学研究和诊断中不可缺少的一种准确性高、简单易行、诊断迅速和能够反复检查的工具。1 免疫电子显微镜技术在病理学中的应用免疫电子显微镜（immunity electron microscopy ，I）技术是免疫组织化学与电子显微镜结合的产物。它具有制备样品简单、标记容易、灵敏度高、特异性强、定位精确等优点。特别是胶体全免疫电镜技术，它可以对抗原同时进行定性、定量、定位的分析与观察，因此已广泛地应用于病理学研究。应用免疫金双重或多重标记法，可
5、将形态、功能和结构的研究融为一体，有利于了解同一组织细胞内不同分子间的相互关系，这对于探讨疾病的发生机制，诊断、鉴别诊断以及指导临床治疗具有重要的意义 3。病理组织常用其特异性的标记物，如肝癌组织过度表达的甲胎蛋白、胰岛样生长因子等，神经内分泌瘤异常分泌的一些激素如 等 4。使用 I技术检测这些抗原的表达，有助于相关病理组织的分型、诊断和鉴别判断。1996 年Haas 对 228 例肾活检病例进行了分析，指出免疫电镜对近一半的病例提供了有价值的信息。其中 21%的病例需依赖电镜进行确诊，26%的病例被提供了肯定性依据或补充信息 5。张太和 等对北京医科大学第一医院肾内科 1995 年 1月19
6、97 年 6 月的 777 例肾活检病例进行光镜、免疫荧光和免疫电镜检查，并将光镜和免疫荧光检查的初步诊断与免疫电镜检查最终诊断结果进行分析比较，从免疫电镜检查在病理诊断中起决定性诊断作用、重要参考作用或与光镜检查相互补作用三方面进行了总结研究。777 例肾活检病例中，免疫电镜检查起决定性或修正诊断作用的病例占 18.5%，起重要参考作用或部分修正作用的病例占 13.5%。免疫电镜检查对约 1/3 的肾活检病例的病理诊断提供了有价值的依据。此外，通过用研究表明在分化差的嗜酸性甲状腺瘤中，仅出现于线粒体周围的基质中。分化较好的则除上述部分外，还可在线粒体峪发现蛋白。提示与线粒体内某些成分相互作用
7、，它可能以类似蛋白激酶样作用激活某种代谢途径，这与嗜酸性甲状腺癌的侵袭行为有关 7。2 透射电子显微镜技术在病理学中的作用和实验研究透射电子显微镜（transmision electron microscopy,）技术是利用某种具有光特性的电子束透射在样品上而被散射，经物镜将样品形成第一次像；然后，再经中间镜和投影镜进行第二次放大成像与荧光屏上。样品需经特殊包埋、超薄切片和染色。技术是唯一使得观察细胞的细微结构成为可能的技术，但由于其观察的样品体积小，所以使其应用价值收受到一定局限。自从透射电镜问世和生物组织超薄切片技术建立以来，能用电镜进一步观察到细胞内部的各种细微结构（如肌微丝、黑色素小体
8、、神经分泌颗粒） ，以及细胞之间的关系（如桥粒紧密连接、基板等） ，因此应用透射电镜可以帮助解决疑难肿瘤的诊断和鉴别诊断，还可探讨肿瘤的组织发生和研究肿瘤的生长特性。 应用上述常用病理学检查方法，大多数肿瘤能获得明确诊断，但尚有 810患者，尤其是分化差的肿瘤或涉及到该肿瘤的组织来源和功能状态时，难以确诊。扫描电镜技术的应用，无疑大大促进了肿瘤病理诊断和研究水平的提高，而且对肿瘤的组织来源、功能状态、发病机制的探讨，对肿瘤患者预后判断等提供了大量极有用的信息，为临床制订最佳治疗方案提供依据。尤其近 10 余年来，通过透射电镜发现了一些新的肾小球疾病，如薄基底膜肾病、纤维样肾小球病及免疫触须样肾
9、小球病等。透射电镜还广泛应用于各种疾病的超微病理诊断和研究，肾脏病的分型诊断，血液病诊断，肿瘤的诊断等 8 。多种酶、蛋白质和抗原等成分的超微结构定性、定位研究 9 。药物等各种因素对细胞超微结构及成分作用观察。病原微生物的超微结构研究 10 。由于病理组织形态的多样性和间变性，在光镜观察受光镜分辨率的限制，对一部分病理组织主要是分化差的像恶性肿瘤等难以作出诊断和分类、分型。因此，在这些病理的诊断中起到了支持和证实作用 11。例如，横纹肌肉瘤的粗细肌丝，尤其是带和肌节。神经内分泌癌的神经内分泌颗粒，无黑色素性黑色素瘤的前黑色素小体等都是相应小细胞恶性肿瘤的特征超微结构。的另一个意义在于鉴别诊断
10、。电子显微镜检查迄今尚未发现可据以诊断肿瘤和恶性肿瘤的特异性的超微结构改变。因此要鉴别是否为肿瘤和肿瘤的良恶性仍主要靠光镜观察。但透射电镜在确定肿瘤细胞的分化程度，鉴别肿瘤的类型和组织发生上可起重要作用。例如鉴别分化差的癌及肉瘤；区分各种恶性小圆细胞肿瘤，如神经母细胞瘤、Ewing 肉瘤、胚胎性横纹肌肉瘤、恶性淋巴瘤及未分化小细胞癌。除了用于研究与诊断具有特定超微结构的小细胞恶性肿瘤外，还通过对线粒体病变程度判断免疫毒素对腺癌的杀伤效果，以及将技术与免疫组法法相结合以深入地认识腺瘤恶变程度 12。3 扫描电子显微镜技术在病理学中的应用扫描电子显微镜（scanning electron micr
11、oscopy,）的原理与光学显微镜和不同。在光镜和下，全部图像一次显示是“静态” 的；而则是在真空的镜体中将集聚得很细的电子束射入样品表面，然后将发生的二次电子电流的图像信号作为时相信号，把一点一点的画面“动态” 地形成二维的图像。样品经固定、脱水、干燥和喷镀（常用金或白金等）形成样品表面的金属薄膜后（330nm ）后，放置中，当电子束射在细胞表面的金属膜上，同时产生的反射电子即形成记录在摄影胶片或荧光扫描屏上的图像。是继光学显微镜和透射电子显微镜之后发展起来的另一种研究表面形态的工具，具有观察表面形态富于立体感、放大范围广、可观察块状样品等特点。因此 S作为病理学研究的工具，近年来也迅速发展
12、起来，特别是在肿瘤细胞和病毒的体外培养试验中 S可以使研究工作者清楚地认识肿瘤和病毒的体外生长情况及生长特性。如在肿瘤胞侵袭性体外检测的观察中，以新剥离的羊膜作为支架，可见癌细胞贴在羊膜上皮生长，从单个细胞到细胞团，并伸出伪足固定在羊膜上皮间隙或在上皮脱落空隙，而在羊膜断面上多数癌细胞侵润，癌细胞体积较上皮细胞大，呈椭圆形，表面有稀疏的颗粒状绒毛，随后的几天内可见癌细胞在羊膜上的退化脱落。而结合血管塑料铸型或冷冻割断技术则可对肉瘤血管分布及转移癌侵润分布进行定位 13。2002 年 11 月，一种新出现的原因不明的急性感染性疾病非典型肺炎 出现于我国广东，这种病从一出现就表现出极强的传染性。短
13、短的几个月已发展为世界范围的传染病，目前已有 29 个国家发现 8 千多病例。为了搞清病因，仅用近 8 天时间，德国科学家通过电镜技术从咽拭子标本中观察到副粘液类病毒，电镜图片和基因序列均在网络公布。香港病毒实验室用电镜技术发现冠状病毒样颗粒（70nm） ，美国从泰国病人标本得到的细胞病变产物中发现冠状病毒样颗粒（70-100nm）, 在同一份标本获得 HMPV PCR 阳性结果；与此同时加拿大、法国、新加坡等地开始使用 PCR 和电镜技术检测副粘液病毒和 HMPV。至此，非典型肺炎的病原学研究获得如下结论：电镜技术可以在病人呼吸道标本和组织培养中看到病毒，为进一对它的探索和研究打下了坚实的基
14、础。4 存在问题电子显微镜技术在病理学的应用并非尽善尽美，有其一定的局限性，实践证明，任何病变从开始到结局到包含着一系列发生发展的演变过程，并非始终如一，在电镜下组织切片上所见到的组织的病变，只是病变发展中某一阶段的表现，并非它的全貌。并且在电镜见到的组织的病变仅仅是局部的病变的表现，不能孤立地将其当作疾病的全部。5 小结与展望目前，病理学主要应用组织切片的光学显微镜进行观察及临床诊断，一般误差率可达 20%-40%。而应用电子显微镜对病理组织的超微结构变化与特异性表达的产物进行定性、定位、定量分析，可以提高临床诊断的正确率。因此，不断提高电镜对疾病的诊断与研究技术，有利于今后更加深入地认识疾
15、病的发病机理及生物学特性，该技术必将在抗病药物的研究与开发，疾病的快速诊断体系的确立中发挥重要的作用。Electronic microscope technique application in pathologyAo Pingxing，GAO Hong*(Agriculture university animal technology college Yunnan Kunming, Yunnan 650201)Abstract Electronic microscope technique is in pathology study develop to emphasize to want
16、the function.It makes pathology the research entered the super microstructural level.This text inquirieds into the Immunity Electronic microscope and the Transmision Electron microscopy and the Scanning Electron microscopy the technique of deeply respectively in the foreground between clinical application in the pathology and its dev
