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1、Smac/DIABLO 与肿瘤治疗的研究进展【关键词】 Smac/NIABLO；细胞凋亡；肿瘤靶向性治疗一直是肿瘤治疗的研究热点，肿瘤细胞与正常细胞区别主要在于：肿瘤细胞具有无限增殖，逃避凋亡，组织侵袭性以及转移的能力。如何在治疗过程中只杀死肿瘤细胞而不影响正常细胞是治疗肿瘤的难点。Smac/NIABLO 是 2000 年首先由 Wang 等1发现并报道，命名为第 2 个线粒体衍生的胱天蛋白酶激活剂（second mitochondriaderived activator of caspase，Smac），确定其位于线粒体中，在凋亡过程中与细胞色素 C 一同由线粒体中释放出来，与细胞凋亡密切相
2、关。同年，Vaux 等 2也报道了这个蛋白，命名为低等电点凋亡抑制蛋白（IAPs）直接结合蛋白（direct IAPbinding protein with low pI,NIABLO）。经过比对分析证实两者为同一种蛋白，即命名为 Smac/NIABLO 蛋白。近年来，Smac/NIABLO 只诱导肿瘤细胞凋亡而不影响正常细胞的特点引起各国研究人员的注意，希望可以将其应用于肿瘤靶向治疗。1 Smac/NIABLO 蛋白的生物学特性人类 Smac/DIABLO 基因位于 12 号染色体长臂,由 7 个外显子组成。 Smac/DIABLO 有Smac/DIABLOL、Smac/ DIA2BLOS
3、和野生型 Smac/ DIABLO 3 种存在形式。Smac/DIABLOL、S 蛋白存在于线粒体内；而野生型的 Smac/ DIABLO 蛋白以纯二聚体的形式存在于线粒体的膜间隙内3，4。Smac/NIABLO 分子的 N 端是由 55 个氨基酸构成的信号肽序列，Smac/NIABLO 前体在进入线粒体后立即被水解去信号肽，只有水解后的 Smac/NIABLO 才具有活性。经 Western印迹实验测出有功能活性的 Smac/NIABLO 是 184 个氨基酸残基，分子量约 21 0003，4。在 2.2 A 分辨率的 X 线下，Smac/NIABLO 单体是一个延伸的 3 个螺旋多肽链组成
4、的束状结构，有中度弯曲，呈拱形。在生理缓冲液中，天然 Smac/NIABLO 呈二聚体状态。单体型 Smac/NIABLO 不能解除 XIAP 对 caspase 的抑制作用。这说明Smac/NIABLO 二聚体状态对其功能来说是必需的5，6 。2002 年 GuoO 等准确定位Smac/NIABLO 的功能集团，即 N 端前 5 个残基与其活性紧密相关7。用甲硫氨酸代替Smac/NIABLO 其 N 端的丙氨酸，则 Smac/NIABLO 完全不能与 IAPs 的 BIR 区域紧密结合而发挥其作用。当 Smac/NIABLO 缺失其 N 端的前 4 个氨基酸残基（AVPI ）时，其与 IAP
5、s 的结合能力极度减弱。可见 Smac/NIABLO 的功能集团主要位于 N 端，C 端辅助其与 IAPs 结合紧密 8。在抗肿瘤药物的开发上，分子量小的蛋白在应用上更加好操作，更少副作用，因此研究人员更加青睐 Smac/NIABLO 蛋白的 N 端小肽。2 Smac/NIABLO 对细胞凋亡的调控作用2.1 细胞凋亡的信号途径 细胞凋亡是一个复杂的生理过程。一般认为细胞凋亡分为受体凋亡途径与线粒体凋亡途径，包括 3 个阶段：诱导期（induction phase）、效应期（effector phase）、降解期（degradation phase）。各种刺激经相应受体，通过效应分子相互作用引
6、起 caspase 家族的级联反应，降解细胞内容物，随之出现细胞凋亡现象。其中 caspase 酶的级联反应被视为大多数凋亡过程中细胞死亡效应期的关键反应，因此控制 caspase 的级联反应就是控制细胞凋亡的枢纽。虽然受体途径与线粒体途径所引发的 caspase 级联反应途径不同，但在某些水平是相互联系的（如图 1 所示）。2.2 Smac/NIABLO 调控细胞凋亡的机制 细胞凋亡每一步骤都受到严格精确的调控。Bcl2 蛋白家族可以激活 caspase 酶原，诱导细胞凋亡，而凋亡抑制蛋白家族（IAPs）可以抑制 caspase 的级联反应，从而阻断细胞凋亡进程9。Smac/NIABLO 可
7、以与 IAPs 家族成员XIAP、cIAP1 、cIAP2 、survivin 等蛋白分子普遍反应，通过除去 IAPs 的抑制作用使 caspase 酶原活化，进而达到促使细胞凋亡的作用。Smac/NIABLO 能与 IAP 反应是因为IAP 家族的所用成员都至少含有 1 个 BIR 基序。实验表明，不同的 BIR 区域表现出不同的功能，在 Fas 诱导的凋亡中，内源性的 XIAP 水解成为二部分，每一部分都有不同的caspase 的特异识别位点， XIAP 的第二个 BIR 区域（BIR2）表现出强的抑制凋亡的能力，而 BIR1 区域与 BIR3 区域却未显示出同样活性10。实验数据显示 S
8、mac/NIABLO 可与XIAP 的 BIR2 和 BIR3 区域稳定反应，而与 BIR1 区域则无反应。另外，BIR2 、BIR3 在与Smac/NIABLO 结合过程中互相排斥，提示它们可能识别 Smac/NIABLO 的同源基序。BIR2可以抑制成熟 caspase3 的催化活性，而 Smac/NIABLO 与 BIR2 区域结合可解除其抑制。在凋亡因子刺激下，位于细胞膜上的 caspase8 活化，但被 XIAP 阻滞，这需要Smac/NIABLO 由线粒体中释放来中和 XIAP 的作用，才允许 caspase8 直接激活效应器，导致细胞凋亡11。由此可见 Smac/DIABLO 和
9、 IAP 是一种竞争性作用，因此可以通过增加 Smac/ DIABLO 表达量实现促进细胞凋亡的目的。此外 Smac/ DIABLO 还具有其他机制来调节 IAP 功能。研究发现,Smac/ DIABLO 可以选择性地使 c2IAP1 和 c2IAP2 泛素化降解而导致两者浓度降低12，这样可以进一步增加 Smac/DIABLO 的相对浓度，促进细胞凋亡。3 Smac/NIABLO 在肿瘤治疗中的应用3.1 Smac/NIABLO 与肿瘤进展的相关性对于 Smac/NIABLO 与肿瘤分期以及癌组织分型的相关性目前结论尚未统一。有的研究发现 Smac/NIABLO 在恶性程度高、低分化的肾细胞
10、癌中蛋白表达水平明显低于恶性程度低、高分化的肾细胞癌13，在肺癌的进展过程中 Smac/NIABLO 的表达水平降低。而有的研究则发现 Smac/NIABLO 蛋白表达水平与肿瘤分期及癌组织分型无关，或者蛋白表达水平与 mRNA 表达水平不一致。目前可以达成共识的是，Smac/NIABLO 与 XIAPs 的比值在期肿瘤中明显高于期与期肿瘤，在高转移性肿瘤中明显高于原位癌14。可见肿瘤进展过程是一个复杂的多方面作用的综合结果，其中 Smac/NIABLO 与 IAPs 蛋白的比值在肿瘤细胞逃避凋亡、无限制的增殖过程中有重要意义。3.2 Smac/NIABLO 与肿瘤治疗 自 2003 年 Ka
11、shkar 等15报道过表达 Smac/NIABLO 可以促使神经母细胞瘤凋亡，这一发现推动了 Smac/NIABLO 作为生物靶向分子，辅助抗肿瘤药物的研究。例如，乳癌MCF7 细胞系属于恶性度高、对诱导凋亡药物不敏感的细胞，利用哺乳动物GFPSmac/NIABLO 表达系统使其在细胞质中表达 GFPSmac/NIABLO 融合蛋白，并转变为对死亡受体敏感的细胞16。研究表明，过表达 Smac/ DIABLO 可以使肿瘤细胞对凋亡刺激更加敏感。在种植肝癌细胞株的裸鼠模型，局部注射可以高表达 Smac/NIABLO 的腺病毒载体与 5氟尿嘧啶，发现肿瘤细胞出现大量凋亡，瘤块明显缩小甚至消失17
12、。尤其是 Smac/NIABLO 蛋白 N 端分离下来的短氨基酸序列也可与 XIAP 反应，作为 caspases的活化剂提高 caspase9、caspase3 的活化能力，一定浓度还可以杀伤 IAPs 过表达的肿瘤细胞。Christina 等18采用 Smac 蛋白衍生的含有 AVPI 氨基酸基序的小分子肽能增强细胞凋亡和多种抗瘤药物的治疗效果。对不同肿瘤细胞系的研究发现，高表达 Smac小肽可促进肿瘤细胞凋亡并增加肿瘤细胞对化疗的敏感性，但 Smac/ DIABLO 并不诱导正常的细胞凋亡14。因此联合 Smac 小肽和抗癌药物进行肿瘤治疗，一方面可以增加药物效果,另一方面还可以减少药物
13、毒性。由此可见，Smac/ DIABLO 小肽分子作为抗肿瘤药物的辅助剂与抗癌药物联合应用具有广泛的应用前景。4 展 望虽然目前在一些肿瘤细胞中发现 Smac/NIABLO 蛋白表达水平与 mRNA 表达水平不一致之类的问题尚未完全解决，但对于 Smac/NIABLO 蛋白近 10 年的研究过程中，将细胞凋亡的基础研究工作向更深层次推进，令细胞凋亡机制的细节更完善；而且研究开发了Smac/NIABLO 蛋白对肿瘤临床治疗的应用价值，使得在肿瘤的生物大分子治疗方面有了重大突破。【 参考文献】1 Du C，Fang M,Li Y,et al.Smac,a mitochondrial protein
14、 that promotes cytochrome dependent caspase activation by elimination IAP inhibition J.Cell，2000；102(1):3342.2 Verhagen AM，Ekert PG，Pakusch M,et al.Identification of DIABLO，a mammalian protein that promotes apoptosis by binding to and antagonizing IAP proteinsJ.Cell，2000；102(1):43 55.3 Srinivasa MS
15、，Datta P，Xun JU,et al.Molecular determinants of the caspasepromoting activity of Smac/ DIABLO and its role in the death receptor pathwayJ.Biol Chem，2000；27(5):361526.4 Adrain C，Emma MC，Seamos JM.Apoptosis 2 associated release of Smac/DIABLO from mitochondria requires active caspases and is blocked b
16、y Bcl2J.Embo J，2001；20(23):662733.5 Chai J，Du C，Wu JW,et al.Structural and Biochemical Basis of Apoptosis Activation by Smac/ DIABLOJ.Nature，2000；406(6798):855 63.6 Srinivasula SM，Hegde R，Saleh A,et al.A conserved XIAP interaction motif in caspase9 and Smac/ DIABLO regulates caspase activity and apoptosisJ.Nature，2001；410(6824):11226.7 Guo F， Nimmanapalli R，Paranawthana S,et
