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1、壮药黄花调气饮的质量控制分析 壮药黄花调气饮为刘华钢教授根据民间验方，运用壮医独特的调气机，通三道治疗原则和临床诊疗经验研制而成的茶剂，该制剂现正在进行制剂注册申请。制剂处方由黄茂、山银花、大枣、浮小麦、甜茶组成，生产工艺为取黄茂、浮小麦、大枣加水煎煮 2 次，合并煎液，滤过，滤液浓缩成清膏后，加入山银花、甜茶粗粉，烘干，粉碎成粗粉，制成袋泡茶。其具有顺气解毒、调气补虚的功用，可通调气道，顺气解毒，用于四时感冒，尤以虚人感冒、老人感冒、小儿感冒更宜。为了控制制剂质量，对处方中黄茂、山银花、甜茶进行薄层色谱(thin layer chromatography TLC)法鉴别，并采用高效液相色谱(
2、high performance liquid chromatographyHPLC)法测定制剂中山银花的有效成分绿原酸。所建立的方法具有较好的分离度、重复性、专属性，且操作简便准确，可以有效地控制壮药黄花调气饮的质量。1 仪器与试药1. 1 仪器岛津高效液相色谱仪 (包括 LC-20A 元泵，SIL-20A 标准自动进样器，SPD-20A 紫外二可见检测器，CTO-20A 柱温箱，CBM-20A 工作站);SartoriusBP211 D 电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司);SK2200 LHC 超声波清洗机(上海科导超声仪器有限公司);Agilent8453 紫外河见分光光度计(美国安捷
3、伦);LG16 -W 高速离心机(北京医用离心机厂);硅胶 G 板、聚酞胺薄膜(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)。试药黄茂对照药材(中国食品药品检定研究院，批号:20120502);绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110753- X00413 );甜茶对照药材(南宁生源中药饮片有限责任公司，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为蔷薇科植物甜叶悬钩子 Rubus suavissimus S. Lee 的干燥叶，批号:100201);甲醇 (色谱纯，美国 Fisher 公司); 水为超纯水，其余试剂为分析纯。壮药黄花调气饮(批号:20110605,20110610,20110614)由广西中
4、医药大学附属瑞康医院制剂室生产。2 TLC 鉴别2. 1 山银花取本品 0. 5 g，加甲醇 10 mL，超声处理 30 min 滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取缺山银花的阴性对照样品 0. 59，同法制成阴性对照溶液。再取绿原酸对照品，加甲醇制成每毫升含 1 mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述溶液各 2 L 分别点于同一聚酞胺薄膜上，以 36%乙酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(波长 365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。缺山银花阴性样品无相应斑点。见图to 2. 2 黄茂取本品 3
5、. 5 g，加甲醇 30 mL，超声处理 1 h,滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100 200 目，10 g,内径为 10 mm)上，用 40%甲醇 100 mL 洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加水30 mL 使溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取 2 次，每次 20 mL，合并正丁醇液，用水洗 2 次，每次 20 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇 1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取缺黄茂的阴性对照样品 3. 59，同法制成阴性对照溶液。再取黄茂对照药材 3g，加甲醇 30 mL，超声处理 1 h,滤过，滤液加于中性氧化铝柱(100 200 目，5g，内径为 10 mm)上，从用 40%甲醇
6、 100 mL 洗脱起，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法实验，吸取上述溶液各 510 L 分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酷(5 : 5)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏后，置紫外灯光(波长365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光主斑点。2. 3 甜茶取本品 g，加甲醇 10 mL，超声处理 30 min 滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇 1 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取缺甜茶的阴性对照样品 g，同法制成阴性对照溶液。再取甜茶对照药材 0. 59，同法制成对照药材溶液，照薄层色谱法实验，吸取上述溶液各 510 L 分别点于同一
7、硅胶 G 薄层板上，以环己烷色酸乙酷一甲酸(8:2:)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯光(波长 365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光主斑点。3 HPLC 法测定山银花中绿原酸色谱条件 Ultimate 色谱柱(250 mm x 4. 6 mm，5 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水冰醋酸(20:80:1)为流动相;柱温 30; 检测波长 327 nm;流速 mL/min;进样量10L。3. 2 对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，制成每毫升含绿原酸 70g。3. 3 供试品溶液的制备取本品约 1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入
8、 50%甲醇 25 mL，密塞，称定质量，超声处理 30 min，放冷，再称定质量，用 50%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液 5 mL，置25 mL 棕色瓶中，加 50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。3. 4 阴性样品溶液的制备分别按处方比例及制剂制备工艺制备不含山银花的阴性样品，再按 3 . 3 项下方法制备，即得。3. 5 专属性实验取阴性样品溶液、对照品溶液和样品溶液，按照 3 . 1 项下色谱条件，注入高效液相色谱仪，进样量 10 L，阴性溶液在绿原酸色谱峰处无干扰峰出现，表明对被测成分无干扰。理论板数按绿原酸峰计算应不低于 6 000。3. 6 线性关系考察
9、精密称取绿原酸对照品 mg 置于25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成浓度为 70. 8 g /mL的绿原酸对照品溶液，取上述绿原酸对照品溶液分别进样2,4,6,8,10,12,14 L 记录绿原酸峰面积值。以对照品进样量 (g)为横坐标(X)，对应峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得回归方程 Y= x 106X-22 423 ( r = 0. 999 9 )，结果表明绿原酸进样量在 0. 141 60. 991 2g 范围内与峰面积呈良好线性关系。3. 7 精密度实验取同一供试品溶液，按 3 . 1 项下色谱条件，连续进样 6 次，进行分析测定绿原酸峰面积值，计算绿原酸含量 RSD 值
10、为 0. 35 % 。3. 8 稳定性实验取同一供试品溶液，分别在0,2,4,6,8,10,12 h 进样，进样量为 10 L，分别测定其峰面积值，RSD =0. 37% (n =7)，表明供试品溶液在 12h 内稳定，3. 9 重复性实验取同一供试品，按 3 . 3 项下方法重复提取 6 份作为供试品溶液，按 3 . 1 项色谱条件进行测定，记录绿原酸峰面积，求出其含量，计算 RSD 值为% (n =6)。加样回收率实验精密称取己知含量的样品 6 份，每份约 0. 5 g，分别精密加入 4. 29 mg/mL 绿原酸对照品溶液 1 mL，按 3 . 3 项下方法制备供试品，按照 3 . 1
11、项下色谱条件分别进样，进样量 10 L,测定峰面积，绿原酸的加样回收率为 102. 2% ，RSD 为 0. 68 %。样品测定按上述色谱条件测定 3 批制剂中绿原酸含量，每批制剂测 3 份，平均含量分别为 8. 01 ,7. 90 , 7 . 92 mg/g。4 讨论笔者曾对制剂中另二味药大枣、浮小麦进行过薄层鉴别，结果在与对照药材色谱相应位置上，有相同颜色的荧光斑点，但阴性对照存在干扰，大枣和浮小麦的薄层鉴别不宜作为壮药黄花调气饮的薄层鉴别项目。根据文献报道，绿原酸对照品溶液在 327 nm 波长处有最大吸收。取绿原酸对照品的甲醇溶液，在紫外分光光度计上进行扫描，测得最大吸收波长为 327 nm，与文献报道相吻合，故本实验采用 327 nm 为检测波长。笔者曾试用流动相: 乙腈-0. 4 %磷酸溶液(13:87)，甲醇-水-冰醋酸(15:85:1)，甲醇-水- 冰醋酸(25 : 75:1)，甲醇-水-冰醋酸(20:80:1)。实验条件摸索证实，采用流动相甲醇-水-冰醋酸(20 : 80 : 1)时，样品中绿原酸与其他杂质峰分离较好，并能在 15 min 内出峰完毕，达到分析要求，故选择甲醇-水-冰醋酸(20:80:1)为流动相。笔者比较 25,30,35柱温对高效液相色谱的影响，实验发现，柱温对绿原酸峰的分离度和保留时间影响不大，因此选择较接近室温的柱温 30。
