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1、桂林理工大学生物工程专业技能实习报告1生姜蛋白酶的提取纯化工艺研究学生姓名： 指导教师： 摘要：本文通过比较研究生姜蛋白酶的提取纯化工艺，采用丙酮沉淀法对生姜蛋白酶进行初步纯化后，通过双水相萃取，反胶束萃取对生姜蛋白酶进行进一步纯化比较，分析了在双水萃取中聚乙二醇分子量，聚乙二醇浓度，硫酸铵浓度、酸盐浓度，磷酸盐缓冲液 pH 对萃取效果的影响。对反胶束萃取中 KCl 浓度以及 W0 值对萃取效果的影响。关键词：生姜蛋白酶；有机溶剂沉淀法；硫酸铵盐析法；双水相萃取；反胶束萃取Research on extraction and purification of Ginger proteaseStu
2、dent: YANG Teacher: Abstract: This article through the comparative study of ginger protease extraction and purification technology, using acetone precipitation of ginger protease for preliminary purification, through the two phasepartitioning, reversedmicelle of ginger protease for further purificat
3、ion comparison, analyzes the dual water extraction in the molecular weight polyethylene glycol (peg), polyethylene glycol (peg) concentration, ammonium sulfate concentration, acid salt concentration, phosphate buffer to the effects of the pH extraction. To reverse micelle concentration in the extrac
4、tion of W0 value and KCl extraction effect.Key words: Ginger protease; organic solvent extraction; ammonium sulfate salting-out; aqueous two-phase extraction; anti-micelle extraction桂林理工大学生物工程专业技能实习报告2前 言生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它在结构与性质上与木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多的相似性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋白酶在肉类嫩化、
5、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好的风味 1。生姜蛋白酶用于酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度。我国传统食品“姜撞奶”用姜汁作为凝乳剂，其中的凝乳因子被证明就是生姜蛋白酶。 2开展生姜蛋白酶的研究将会为其在食品领域的应用提供理论依据, 改变我国植物蛋白酶资源长期以来主要依赖于木瓜、菠萝等少数热带水果资源的现状, 对于稳定生姜种植面积, 保证生姜产业持续高效发展, 扩大生姜资源的利用途径, 调节农业产业结构均具有重要意义,对于进一步丰富生姜蛋白酶的酶学性质和以生姜为原料开发新型的营养保健制品也具有积极
6、的作用和指导意义。生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类，通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大都以丙酮粉作为酶的来源，沉淀剂对酶及蛋白质进行沉淀，从而将生姜蛋白酶从大量的杂质中分离出来，制成丙酮粉后还可以在低温下长期保藏，其性质十分稳定；唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜洗净切碎榨汁离心除去淀粉抽滤超滤取浓汁真空冷冻干燥保存。近几年的一些新的提取方法，则综合运用了上述各种方法，例如：2000 年，Kyung在研究生姜蛋白酶的氨基酸序列时，采用如下的提取方法：生姜切成小块，3下，在1000 mL 20 mM
7、7.0 的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌 1 h 然后用纱布过滤，取滤液。滤渣再用 500 mL 缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入 2的氯化钠，搅拌 2 h，在4下 15000g 离心 30 min。上清液用硅藻土过滤以除去悬浮物，然后加入硫酸铵至20饱和度，将溶液搅拌 1 h，然后 13000g 离心 30 min，上清液继续添加硫酸铵至60饱和度，用 NaOH 调节 pH 至 7.2，4下搅拌 3h，离心取沉淀，用约 150mL 20 mM pH 为 7.0 的磷酸缓冲液（含有 5 mM 的连四硫酸钠）溶解。溶液用截流分子量为 12000的透析袋对 20 mM pH 为 7.0 的磷酸缓冲液
8、（其中含有 5 mM 的连四硫酸钠，1mMEDTA）透析 16 h 以上。透析液在 4下 10000g 离心 30min 以除去任何不溶性物质的粗酶液，并在此基础上进行层析纯化。又如：2005 年，Adulyatham 等在研究生姜蛋白酶的部分纯化和稳定性的时候采用如下的提取方法 ：鲜姜，切片，与 4 倍（w/v）的冷 Tris-盐桂林理工大学生物工程专业技能实习报告3酸缓冲溶液（0.05M, pH8.0）混合均匀，均质，四层纱布过滤，滤液在 5，12000g的离心机中离心 20 min。上清液，即生姜蛋白酶，在 5保存。 3谢芳在其硕士学位研究论文中研究了双水相提取纯化生姜蛋白酶的技术，提出
9、了三步双水相萃取的方案。生姜粗酶液 3ml +PEG、盐（30%PEG+10%（NH 4） 2SO4）-取上相+盐（20%（NH 4） 2SO4 10ml）-取上相+盐（ 12%（NH 4） 2SO4 15ml）-下相即为提取纯化后的生姜蛋白酶酶液。在其研究中获得了一系列提取生姜蛋白的最佳条件，如 PEG 最佳分子量为 4000，PEG 最佳浓度为 25%，硫酸铵为最佳盐类反胶束在提取纯化生姜蛋白酶的报道较少，但在提取其他植物蛋白酶已经有所研究及报告。反胶束萃取技术是基于液-液萃取的原理，通常包括萃取和反萃取过程。在有机溶剂相和水相两宏观相界面间的表面活性剂层同邻近的蛋白质分子发生静电吸引，接
10、着两界面形成含有蛋白质的反胶束，然后扩散到有机相中，实现了蛋白质的萃取即前萃过程。改变水相条件(如pH 值、离子种类或离子强度)，又可使蛋白质从有机相中返回到水相中，实现了蛋白质的反萃取即后萃过程。不同的表面活性剂所形成的反胶束，其蛋白质的提取率及提取出来的蛋白质都有差异。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告41 实验原理1.1 有机溶剂沉淀蛋白质原理有机溶剂沉淀法的机理一般可分为两种：早起人们认为加入有机溶剂后，会使水的介电常数降低，从而使蛋白质分之间的静电引力增大，而导致凝集和沉淀；后来又提出另一种说法，认为有机溶剂沉淀法的作用机理是蛋白质的溶剂化，使原来和蛋白质结合的水被溶剂取代，从而降
11、低他们的溶解度。近年来又有说法认为有机溶剂可能破坏蛋白质的某种键，使其空间结构发生某种程度的变化，使疏水基团暴露于表面，并与有机溶剂结合形成疏水层，从而使蛋白质沉淀，当空间结构发生形变到一定程度时便会导致完全的变性。1.2 盐析法在蛋白质溶液中加入中性盐会使蛋白质脱水，又会中和蛋白质所带电荷，使颗粒间的相互排斥力失去，而在布朗运动的相互碰撞下蛋白质分子结合成聚集物而沉淀析出。1.3 双水相萃取原理由于高聚物间的互不相容性和空间阻碍作用使高聚物无法相互渗透，不能形成均一性，形成两相，利用生物物质在不相容的两水相间分配系数的差异进行萃取的，从而实现他们的分离。1.4 反胶束萃取原理将表面活性剂溶于
12、水中，当其浓度超过临界胶束浓度时，表面活性剂就会在水中聚集在一起形成聚集体，在通常状态下，这种聚集体是水中的胶束，称为正常胶束。若将表面活性剂溶于非极性的有机溶剂中，并使其浓度超过临界胶束浓度，便会在有机溶剂内形成聚集体，这种聚集体称为反胶束。蛋白质进入反胶束溶液是一种协同过程。在宏观两相界面间的表面活性剂层，同临近的蛋白质发生静电作用而形变，接着在两相界面形成包含有蛋白质的反胶束，此胶束扩散进入有机相，从而实现蛋白质的萃取， 。改变水相条件又可以使蛋白质由有机相重返水相，实现反萃取过程。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告52 实验部分2.1 材料、试剂与仪器2.1.2 实验原料市售新鲜生姜
13、2.1.3 主要试剂磷酸缓冲液（0.05mol/l,pH7.5），无水乙醇，柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液（0.05mol/l pH6.0）, 丙酮 , 硫酸铵，PEG（分子量为 1000,2000,4000） ， NaH2 PO4 -Na2 HPO4 （PH6.5） ，40%PBS，异辛烷，AOT， 0.2MKCL、0.4MKCL、0.1MNaCl、0.2 MNaCl、0.4 MNaC，CTAB，正辛醇，考马斯亮蓝 G-250 溶液，牛血清蛋白，酪蛋白标准样，0.4mol/l 三氯乙酸，2.1.4 主要仪器研钵，容量瓶，试管，离心机，离心管，移液管，紫外分光光度计，2.2 实验方法2.2.1 生姜
14、蛋白酶的常规提取纯化工艺2.2.1.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜 50 g，切成小块，按料液比 1：2 加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5） ，研磨匀浆 30 min，所得浆液用八层纱布过滤，滤渣用少量磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5 ）洗涤后，收集滤液 4静置 2h 后，离心（4000rpm，10 min）去除沉淀，上清液用磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5）定容至 100mL（生姜蛋白酶溶液 A） ，4冰箱贮存待用。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.1.2 乙醇沉淀法取
15、生姜蛋白酶溶液 A 20mL，加入 1.5 倍的无水乙醇进行沉淀，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。沉淀用 0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 10mL（生姜蛋白酶溶液 B） 。取样按 2.2.6方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。桂林理工大学生物工程专业技能实习报告62.2.1.3 丙酮沉淀法取生姜蛋白酶溶液 A 20mL，加入 1.5 倍的 4预冷丙酮进行沉淀，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min）去除上清液后收集沉淀（即粗酶） 。沉淀用 0.05mol/L pH6.0 的柠檬
16、酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 10mL（生姜蛋白酶溶液 C） 。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.1.4 盐析法取生姜蛋白酶溶液 A 20mL，加入固体硫酸铵至 40%饱和度，4静置 30min 后，离心（4000rpm，10 min） ，收集上清液继续加入硫酸铵至 60%的饱和度，4静置 过夜后，离心（4000rpm，10 min） ，收集沉淀。0.05mol/L pH6.0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液溶解并定容至 10mL（生姜蛋白酶溶液 D） 。取样按 2.2.6 方法测定蛋白质含量，按 2.2.7 方法测定酶活。2.2.2 生姜蛋白酶聚乙二醇/硫酸铵双水相萃取工艺2.2.2.1 生姜蛋白酶的提取取外形完好，无机械损伤和腐烂，富含纤维的生姜 50 g，切成小块，按料液比 1：2 加入磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH 7.5） ，研磨（粉碎）匀浆 30 min，所得浆液用八层纱布过
