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1、NSCLC 之 EGFR 突变检测共识肺癌目前是全球死亡率最高的恶性肿瘤，据估计，2010 年因肺癌致死的患者数超过结直肠癌、乳腺癌及前列腺癌的总和，虽然学者们一起致力于肺癌的研究，但是其 5 年生存率仍仅为 10%。随着吉非替尼、厄洛替尼等针对表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂（TKI）的问世，非小细胞肺癌（ NSCLC）的治疗开始了新的时代，已有多个临床试验证实 TKI在 NSCLC 中有效，特别是对于女性、无吸烟史、腺癌患者。2004 年，EGFR 的酪氨酸激酶突变被发现，且认为其与 TKI 疗效相关。最近的一项临床研究表明，吉非替尼在 EGFR突变的 NSCLC 一线治疗上，
2、较紫杉醇联合卡铂的化疗，可以明显延长无疾病进展时间（PFS），并提高疗效，因此， EGFR 突变对于 TKI 在 NSCLC 治疗上有指导性的意义。EGFR 最常见的敏化突变包换外显子 19 的少量缺失（亮氨酸- 精氨酸-谷氨酸-丙氨酸缺失）和外显子 21 的 L858R 点突变（亮氨酸-精氨酸的互换），这两种突变占目前已经的NSCLC 中活化的 EGFR 突变的 8590%，而外显子 20 的突变则与 TKI 耐药相关。1. EGFR 突变检测的常规问题EGFR 突变检测在临床实践中成功开展的核心在于多学科的相互沟通、联系及合作，这一过程包括临床医师、病理学家、分子生物学家和放射学家，而相关
3、人员对于 EGFR 突变检测的认知程序也是关键所在。1.1 什么样的患者需要检测？临床医师在患者疾病诊断明确时就应该决定该患者是否应当进行 EGFR 突变检测，而这一决定必须依赖于良好的组织取材基础上。因此，在初次诊断时，如何采取最佳的生物活检方式，如何保存以及以便于随后的时间中检测则显得尤其重要。尽管对于所有的 NSCLC 患者都应该考虑行 EGFR 突变检测，但是目前还是主张把重点放在那些腺癌和/ 或无吸烟史的患者上，原因在于大部分的基因突变发生于这些患者。初筛策略还处于讨论阶段，对此尚没有达成共识。免疫组织化学是一种有效的初筛手段，它可以在蛋白水平检测出最常见的及相关的突变，特别是外显子
4、 19 的缺失，但是不能发现所有突变。循环肿瘤细胞也可以作为初筛手段，但是其受限于细胞数目及检测难度。1.2 如何安排检测过程的时间？检测应该在组织活检 24 小时内进行，常规病理结果应该在 12 天内完成（免疫组织化学除外），EGFR 突变测定须在 57 个工作日完成，从取样到出具结果时间不应超过 10 个工作日。2. 活检和组织取样方法2.1 什么时候进行组织采集？一般来说，很少会专门为进行 EGFR 突变测定来采集组织，因此，肿瘤初诊时的标本也就是基因检测的标本，所以，临床医师在最初的诊治过程中就应该考虑到后期可能将要进行的相关检测，而尽可能地获得足够的组织，以便日后的工作。如果肿瘤组织
5、测定失败时，也可以考虑采集血液或血浆标本来进行 EGFR 突变测定，但是目前认为这些手段仍处于试验阶段。2.2 活检哪里的肿瘤组织？活检何处组织应由此操作的临床医师决定，一般来说，多选取那些易于取材的肿瘤组织。病理学家对于组织的来源并不在意，但是大家对于原发病灶和转移灶之间的 EGFR 突变可能存在差异表示共识。2.3 采用何种活检方式及样本要求？现已有多种组织活检手段来获取高质量的肿瘤组织样本，包括：细针穿刺活检、经支气管活检、CT 引导下的细针穿刺活检、纵隔镜、胸腔镜及开胸手术。对于不同活检手段所获得的组织要求见表 1.2.4 体积肿瘤组织可以成功检测？在进行分子学分析之前，对于肿瘤组织样
6、本的分析应当进行，旨在评估后续检测结果的可靠性。目前，共识认为在样本中肿瘤细胞与正常细胞的比例对于肿瘤特异性突变检测至关重要，因此，推荐对于组织样本进行不同细胞比例测定，所以对于肿瘤细胞富贵的组织进行基因突变检测结果的精确性较高。突变检测对于细胞数目的要求尚无统一标准，目前共识认为应取得尽可能多的细胞。理想状态下，一个样本中至少包括 200400 外肿瘤细胞来进行突变检测，但是在实际中很难达到（指导细针穿刺及经支气管活检标本）。对于 DNA 测序而言，肿瘤细胞的比例至少就在 50%以上，随着技术的发展，肿瘤细胞比例在 1020% 时也可以进行检测，甚至利于某些更为精确的手段，细胞比例在10%的
7、样本也可以检测。活检样本要求21-g 细针 19-g 细针 经支气管 CT 引导细针细胞数目 100 150 300 500活检数目 4 4 45 232.5 如何准备样本？对于肿瘤样本的处理应该标准化，共识认为最佳固定方法是应用 10%中性- 缓冲福尔马林，而不是布安液等其他固定液。固定时间尽可能短，一般来说，小标本的固定时间在612 小时，大一些的手术标本固定时间在 818 小时，这样可以取得最佳检测结果。DNA 提取的标准组织是福尔马林固定-石蜡包埋组织，需要 16 张厚度为 510um 的切片。值得注意的是，如果采取自动化固定及切片，可能会导致 DNA 的变性。2.6 细胞学样本可以检
8、测吗？浆膜腔积液等获取的细胞学样本可能也可能进行检测，但是需要进一步的研究证实其在临床实践中的可靠性，因此，对于临床医师而言，应尽可能地获取组织学标本进行突变检测。3. EGFR 突变检测的标准方法3.1 DNA 提取的最佳方法？目前有很多方法提取 DNA，但是哪一种是最佳还没有定论。在组织样本较少时，推荐使用 Gentra Puregene Blood kit（一种试剂）方法，而在组织样本较丰富时，推荐使用QIAGEN FFPET kit 方法。当然，关于 DNA 提取最佳方法的研究值得进一步进行。共识认为，扩增后的 DNA 品质较 DNA 本身品质更为重要，而突变检测只有在聚合酶链反应（P
9、CR）放大后的 DNA 经判断合格后方能进行。为了提高检测结果，共识推荐检测过程中的质量控制（QA），它是基于样本质量的标准制定的，而 QA 结果也应该告之临床医师，如果一份样本的 EGFR 突变为阳性，但是其未达到 QA，而需要进行一次标准 EGFR 突变检测，而一些报告则为非常罕见的假阳性。如果一份样本结果为阴性，但未达到QA，此份报告应为：未见基因突变，可能与标本质量差相关。3.2 EGFR 突变检测的最佳方法？现在有多种方法可能进行 EGFR 突变的检测，包括：直接测序法、放大受阻突变系统（ARMS ）、突变高效液相色谱法、长度分析等。这些方法各有利弊，对此，尚无共识认为何种方法最佳。
10、某些方法只能测定常见的活化突变，而某些则可以测定所有的突变。基因测序法目前应用最为广泛，它可以检测出所有的突变，不过耗时较多，但它不需要批处理样本，且可以进一步避免污染，结果更为精确，还能够发现一些特殊突变。3.3 何时须重新检测？当出现以下情况时须重新检测：由于假阳性可能性而发现的新突变、测序数据较少或没有达到其他 QA 标准等。重新检测的方法包括：重新进行 PCR、外显子 19 片段分析（更为敏感）、重新提取 DNA，如果有可能检测另一份样本或与其他病理学家分析。3.4 结果该如何报告？基因突变报告应该由病理学家或与分子生物学专家共同发布。一份完整的报告需要包含以下内容：检测组织内容、样本
11、来源、活检方法、样本大小及质量、样本中提取 DNA的内容、检测方法、外显子测定及突变情况。特殊突变以及它们与 TKI 疗效的关联性也需要记录，例如 TKI 的敏化基因、耐药基因以及某些未和突变的关联性。对于新的突变，需要在 Greek 基因突变数据库中检索，发现其与临床实践的关联性，同时也需要做相应的记录，提示临床医师所发现的新突变。解释检测结果的相关内容也需要记录，如试验的敏感性（样本中肿瘤细胞比例等）和 QA 标准。4. 总结预测 TKI 在 NSCLC 治疗中临床病理特征在既往研究中已经提及，包括女性、腺癌、无吸烟史，而近期的研究则建议个体化治疗中用分子学指标来代替它们。这些分子标志物中，最主要的是 EGFR 的活化突变，相关临床研究业已证实在 EGFR 突变的患者中，应用吉非替尼优于化疗。EGFR 突变检测的欧洲共识则为 NSCLC 患者相关筛选制定的检测标准，从而可以更加准确地应用 TKI 制剂。在将来的临床研究和实践中，还需要进一步的研究确定最佳检测手段。
