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1、细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、 定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。 二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法） ，Hoechst33342/PI 双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等。不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI 单染色法流式细胞仪检测等。三、样品来源不同选择组织：主要用形态学
2、方法(HE 染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA 或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。四、细胞凋亡检测1、 早期检测 : 1) PS(磷脂酰丝氨酸 )在细胞外膜上的检测2)细胞内氧化还原状态改变的检测3)细胞色素 C 的定位检测 4) 线粒体膜电位变化的检测2、 晚期检测： 细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核 DNA，产生大量长度在180-200 bp 的 DNA 片段。对于晚期检测通常有以下方法： 1) TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记)2) LM-PCR Ladder (连接介导的 PCR 检测) 3) Telemerase
3、Detection (端粒酶检测)3、生化检测：1）典型的生化特征： DNA 片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记）4）通过 DNA 末端转移酶将带标记的 dNTP （多为 dUTP）间接或直接接到DNA 片段的 3-OH 端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。4、LM-PCR Ladder (连接介导的 PCR 检测) 当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核 DNA 的变
4、化。通过 LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯 DNA 后，用 32P-ATP 和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT ）使DNA 标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中 DNA ladder 的形成。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核 DNA 断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。其它方法：1）Telemerase Detect
5、ion (端粒酶检测) 端粒酶是由 RNA 和蛋白组成，它可以自身 RNA 为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA 水平的检测 研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和 bcl-X (长的)
6、 作为抗凋亡（ bcl-2 和 bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量 PCR 技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测 fas, bax-alpha 和 bcl-X (长的) 基因的 mRNA 表达水平来进行细胞凋亡的检测。 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被 GSH 还原而定期去除，氧化型的 GSH 又可被 GSH 还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内 GSH 的排除非常活跃时，细胞液就由还
7、原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase 的级联反应。6、细胞色素 C 的定位检测 细胞色素 C 作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合 Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动 caspase级联反应：细胞色素 C/Apaf-1 复合物激活 caspase-9，后者再激活 caspase-3和其它下游 caspase
8、。 7、线粒体膜电位变化的检测： 1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT 孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1）若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成 PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同
9、保温，细胞核即开始凋亡变化。2）形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；3）凝胶电泳检测 DNA 破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。用于流式细胞仪检测的染料：PI、 Hoechst、 EB、 DAPI、丫啶橙等，其中 PI、Hoechst 最常用。PI 和 Hoechst33342 双标： PI、 Hoechst33342 均可与细胞核 DNA（或 RNA）结合。但是 PI 不能通过正常的细胞膜，Hoechst 则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为 PI 着红色。正常细
10、胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst 着色，但是正常细胞核的 Hoechst 着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。 故 PI 着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的 Hoechst 着色的为调亡细胞。PI 和 Annexin-V 双标：磷脂酰丝氨酸（PS ）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。 Annexin-V（ green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V 可为阳性（早期的坏死细胞可
11、能为阴性） 。但是只有坏死的细胞 PI 是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1)用苏木素- 伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞） ，正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2)Giemsa 染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1）细胞体积变小，全面皱缩；2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：期的细胞核
12、呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；a 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；b 期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、 PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB 等Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI 三种染料与 DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在 DNA 的 A-T 碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。1）PI 双染色法基本原理Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342 在凋亡细胞中的荧光强度要比正
13、常细胞中要高。DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将 Annexin-V 与 PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。注意事项：细胞凋亡时，其 DNA 可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种 DNA 可染性降低也可能是因为 DNA 含量的降低，或者是因为 DNA 结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体 DNA 首先
14、在内源性的核酸水解酶的作用下降解为 50-300kb 的大片段。然后大约 30 的染色体 DNA 在 Ca +和 Mg+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180200bp 核小体 DNA 多聚体。DNA 双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列 DNA 的 3-OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL） 。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断
15、裂，因而没有 3-OH 形成，很少能够被染色。低分子量的 DNA 分离后，也可使用 DNA 聚合酶进行缺口翻译（nick translation） ，使低分子量的 DNA 标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍
16、生物地高辛（digoxigenin）-11-dUTP在 TdT 酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链 DNA 的 3-OH 末端，与 dATP 形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到 1，若此抗体的 Fc 部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞 Fc 受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一)试剂配制1、磷酸缓冲液 PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。2、蛋白酶 K（200g/ml ， pH7.4）：蛋白酶 K 0.02g；PBS 100ml。 3、含 2%H2O2 的 PBS
