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1、59第五章基因克隆技术基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或 DNA 片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是 DNA 重组技术，它利用酶学方法将不同来源的 DNA 分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合 DNA 分子。在此基础上将杂合 DNA 分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。基因克隆的一般程序为：一、获取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或 DNA 片段。获取目
2、的基因的主要方法：1、用限制性内切酶酶解染色体 DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。2、分离纯化细胞中的 mRNA，以 mRNA 为模板，在反转录酶作用下生成 cDNA 第一链，再以 cDNA 第一链为模板在 DNA 聚合酶作用下生成双链 cDNA,构建 cDNA 文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成
3、熟的 mRNA 分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成 DNA 的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个 DNA 片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。4、PCR 法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用 PCR 法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或 DNA 片段，或用反向PCR 技术，先将特定 mRNA 反转录为 cDNA 第一链，然后再进行扩增。用 PCR 法筛选基因
4、，需要对目的基因的 DNA 序列至少有部分了解。二、选择适当的载体按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性 DNA 一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源 DNA 片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状 DNA 分子； (2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源 DNA 片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基
5、因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。1、质粒载体 质粒是细菌染色体外小型环状 DNA 复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(310kb)；含松弛型复制子因而60在宿主细胞的拷贝数高；在复制子外适当位置有由多个单一内切酶位点组成的多克隆区，极有利于外源 DNA 片段的插入；具有抗药性及插入失活标记，可以从平板中直接筛选阳性重组子。但由于质粒分子太小，只能接受小于 15kb 的外源 DNA 片段的插入。因此，插入片段过大，会导致重组子扩增速度减慢甚至插入片段丢失。2、噬菌体载体 目前使用的噬菌体载体主要有 噬菌体、C
6、osmid 及 M13 噬菌体等。 噬菌体是一种能感染大肠杆菌的病毒，其基因组为线状双链 DNA 分子。在 噬菌体 DNA(DNA)的中间 1/3 处，是可被替换而不影响噬菌体生长的“非生活区” ，此区的 DNA 可通过遗传工程技术由外来 DNA 片段所替代。DNA 作为载体的优点是：在体外可包装成病毒颗粒高效地感染大肠杆菌；载体容量大，可将 2325kb 的外源 DNA 片段引入其内；筛选和保存较为方便。M13 也是大肠杆菌噬菌体，其基因组为单链线性 DNA 分子。感染大肠杆菌后，此单链DNA 转变为复制型双链 DNA。克隆复制后，仍以单链形式包装成新的噬菌体释放到介质中。M13DNA 分子
7、中有一长 507 个核苷酸的小“ 非生活区”可以被外来 DNA 片段取代。M 13 载体的主要优点是重组的 M13DNA 仍为单链结构，所以能方便地用于 Sanger 双脱氧法测定所克隆 DNA片段的序列，或用于合成 RNA 探针的模板。M 13 载体的主要问题是容量太小，当插入片段大于1000 个核苷酸时就很不稳定，容易在增殖的过程中丢失。Cosmid 载体从结构上看成是一种人工构建的杂种载体，由噬菌体 DNA 和质粒 DNA 的某些功能片段拼接而成，其转染细胞及病毒颗粒包装与 DNA 相似，但在细胞内的复制则与质粒相同。与 DNA 相比，Cosmid 的主要优点是载体容量很大，插入 DNA
8、 片段的长度可高达45kb。三、构建重组体DNA 体外重组是将目的基因在 DNA 连接酶作用下，连接到合适的载体 DNA 上，以便下一步转化之用。这种由两种不同 DNA 片段重新组合而成的 DNA 称重组 DNA，简称重组体。连接方式有粘端连接和平端连接等多种形式。（1）粘端连接：用相同的限制性内切酶酶切目的基因和载体 DNA 分子，使之产生相同的粘性末端，在适当的温度下，两种 DNA 分子的粘性末端互补配对，再用 DNA 连接酶共价连接，成为完整的重组体。由于粘端连接具有很高的重组效率，在实验中为首选方法。许多情况下，目的基因上找不到适当的与载体上相同的限制性酶切位点。此时可通过在目的基因两
9、端连上人工接头(含适当限制性酶切位点的合成 DNA 小片段) ，再经酶切后即可得到所需的粘性末端。（2）平端连接：在目的基因和载体分子上找不到匹配的限制性酶切点时，可采用平端连接法。少数酶酶切后能直接产生平末端，多数情况下先酶切产生粘性末端，再通过补平反应后成为带平末端的分子。虽然平端连接有更广的适应性，但重组效率远不如粘端连接，阳性重组子筛选的难度也更大。四、将重组 DNA 引入宿主细胞现用原核宿主细胞以大肠杆菌(Ecoli)为主。在基因工程中，由于重组 DNA 是体外制备的，将其转入宿主细胞后，可能会受到宿主细胞限制酶的切割。因此宿主菌必须是无限制基因(或作61用)的突变株(r 株)，如常
10、用的 Ecoli 株 HB101，DH 1 等。一般将噬菌体 DNA 引入宿主细胞称为转染(transfection)，将质粒 DNA 引入宿主细胞称为转化(transformation)。在导入重组 DNA 前，宿主菌用冷 CaCl2 溶液处理，使其细胞膜透性增加而成为感受态细胞，以利于重组 DNA 分子的进入。五、筛选与鉴定重组体克隆两者相辅相成，互相验证。阳性重组体的筛选可利用载体上的遗传标志，包括抗药性(采用无抗药性的受体菌)、氨基酸合成酸系(用缺该酶系的异养型受体菌)和颜色反应( 如 互补效应)等。另一种筛选方法是菌落杂交，将平皿上的转化菌落转印到硝酸纤维膜上，经碱处理使 DNA变性
11、，然后用目的基因的标记探针与之杂交，漂洗去多余的探针后进行放射性自显影，根据显影片上的斑点可判断含有目的基因的菌落。重组 DNA 的鉴定有多种方法，如限制性酶切图谱、DNA 测序，Southern 印迹杂交等，可根据情况酌情使用。 实验十三 质粒 DNA 的小量快速提取原理在碱性条件下，染色体 DNA 和质粒 DNA 都发生变性，但质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当用酸性的高盐缓冲液将 pH 中和至中性时，变性的质粒DNA 又恢复到原来的构型并溶解在溶液中，而染色体 DNA 不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，缠结的染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA、
12、蛋白质SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去。上清液中的质粒 DNA 因不溶于 70的乙醇，可在加入乙醇后通过离心得到质粒DNA 沉淀。试剂1、LB 培养基蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl10g 加重蒸水 950ml，待完全溶解后，用 1N NaOH 调pH 至 7.0，补加重蒸水至总体积 1000ml，151bf/in 2 高压蒸气灭菌 20 分钟。2、氨苄青霉素：100mg/ml3、溶液：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L TrisHCl(pH8.0)；10mmol/L EDAT(pH8.0)4、溶液(临用时配)：0.2mol/L NaOH，1SDS5、溶液：0.5mol/
13、L 乙酸钾 60ml；冰乙酸 11.5ml；H 2O28.5ml6、酚氯仿：将酚和氯仿等体积混合后用 0.1mol/L TrisHCl (pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖 0.01mol/L TrisHCl (pH7.6)液层，4保存。7、氯仿异戊醇：将氯仿和异戊醇按 24：1 的比例混合。8、TE 缓冲液(pH8.0)：10mol/L Tris-HCl(pH8.0)；1mmol/L EDAT629、RNase 1mg/ml：称 10mg RNase 于 Eppendorf 管中，溶于 1ml 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L N
14、aCl 溶液中，于 100加热 15 分钟，缓慢冷却至室温，此液为 10mg/ml RNase 浓度，应用时稀释至 1mg/ml。10、70乙醇、无水乙醇操作1、将含有 pBS-SK 质粒的大肠杆菌 XL1-blue 10l 接种到 10ml 含氨苄青霉素(100g /ml)的LB 培养液中，37振摇过液。2、取 1.5ml 菌液转入 Eppendorf 管中，5000rpm 离心 1 分钟，吸净上清。3、将细菌沉淀重悬于 100l 用冰预冷的溶液中，剧烈振荡。4、加 200l 新配制的溶液，盖紧管口，轻缓颠倒 Eppendorf 管 5 次，以混合内容物，禁止剧烈振荡。置冰浴中放置 5 分钟
15、。5、加 150l 用冰预冷的溶液，盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，随后置冰浴中 5 分钟。6、用微量台式高速离心机 12000rpm 离心 5 分钟，将上清转入另一 Eppendorf 管中。7、加等体积酚氯仿，剧烈振荡 1 分钟后，12000rpm 离心 5 分钟，将上层液转入另一Eppendorf 管中。8、加等体积氯仿异戊醇，剧烈振荡 10 秒钟后，短暂离心 12000rpm1 分钟，将上层液转入另一 Eppendorf 管中。9、室温下加 2 倍体积的无水乙醇，振荡混合，室温下静置 5 分钟。10、12000rpm 离心 5 分钟，去上清液，加 1ml 7
16、0乙醇，短暂振摇，然后再离心(12000rpm分钟)。11、除去所有上清液，待待残余乙醇挥发干净后，加 30lTE 缓冲液(pH8.0) 溶解沉淀，加1l RNase (1mg/ml)，37保温 15 分钟，取出后即可用于酶切分析或置-20 保存备用。实验十四 人外周血白细胞 DNA 制备一、原理从全血制备白细胞 DNA，可用非离子去污剂 Triton X-100 直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，在反应体系中含一定浓度蔗糖，维护核膜内外的渗透压，以防止核膜破裂，通过离心等手段即可获得白细胞的细胞核。向核悬液中加入 SDS 破坏核膜，并使 DNA 从核蛋白中解离，经蛋白酶 K，酚/氯仿抽提等常规制备 DNA 程序，即可获得白细胞DNA。Triton X-100 直接法，操作简便，经济，DNA 得率高，可用于临床。二、试剂和器材试剂631、溶液(pH7.6)：0.32mol/L 蔗糖；5mmol/L MgCl2；1
