《食物中核黄素的测定方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《食物中核黄素的测定方法（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、123911990中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准食 物 中 核 黄 素 的 测 定 方 法Method for determination of riboflavin in foodsGB/T 1239119901 主 题 内 容 与 适 用 范 围本 标 准 规 定 了 用 微 生 物 法 和 荧 光 法 测 定 食 物 中 核 黄 素 含 量 。 本 标 准 适 用 于 各 类 食 物 中 核 黄 的 测 定 。第 一 篇 微 生 物 法2 原 理某 一 种 微 生 物 的 生 长 （ 繁 殖 ） 必 需 某 些 维 生 素 。 例 如 干 酪 乳 酸 杆 菌 （ Lactob
2、acillus casei， 简 称 L .C. ） 的 生 长 需 要 核 黄 素 ； 培 养 基 中 若 缺 乏 这种维生素该细菌； 便不能生长。 在一定 条件下， 该细菌生长情况。 以及它的代谢 物乳酸的浓度与培养基中该维生素含量成正比， 因此可以用酸度及混浊度的测定 法 来 测 定 样 品 中 核 黄 素 的 含 量 。3 试 剂本 实 验 用 水 均 需 蒸 馏 水 。 试 剂 纯 度 均 为 分 析 纯 。3 13 23 33 43 53 63 73 83 93 10冰 乙 酸 。甲 苯 。 无 水乙 酸 钠 。 乙酸 铅 。 氢 氧化 铵 。干 酪 乳 酸 杆 菌 （ Lacto
3、bacillus casei ATCC 7489） 。 盐 酸 ： 0.1 mol/L。氢 氧 化 钠 ： 1 mol/L 和 0.1 mol/L。0.9%氯 化 钠 溶 液 （ 生 理 盐 水 ） ： 使 用 前 应 进 行 灭 菌 处 理 。 核 黄 素 标 准 储备 液 （ 25 ug/mL） ： 将 标 准 品 核 黄 素 粉 状 结 晶 置 于 真 空 干 燥器或盛有硫酸的干燥器中。经过 24 h 后。准确称 取 50 mg，置于 2 L 容 量瓶中，加 入 2.4 mL 冰 乙 酸 和 1.5 L 水。将容量瓶置于温水中摇动，待其溶解，冷至室 温 ， 稀 释 至 2 L， 移 至
4、棕 色 瓶 内 ， 加 少 许 甲 苯 盖 于 溶 液 表 面 ， 于 冰 箱 中 保 存 。311 核黄素标准中间液（10 ug /mL）,准确吸取 20 mL 核黄素标准储备液，加 水 稀 释 至 50 mL。312 核黄素标准中间液（0.1 ug/mL） ，准确吸取 1.0 mL 中间液于 100 mL 容量 瓶 中 ， 加 水 稀 释 至 刻 度 ， 摇 匀 。 每 次 分 析 要 配 制 新 标 准 使 用 液 。313 碱处理蛋白胨：分别称取 40 g 蛋白胨和 20 g 氢氧化钠于 250 mL 水中。混合后，放于 370.5恒温箱内，2448 h 后取出，用冰乙酸调节 pH 至
5、 6.8，加 14 g 无水乙酸钠（或 23.28 含有 3 分子结晶水的乙酸钠） ，稀释至 800 mL， 加 少 许 甲 苯 盛 于 溶 液 表 面 ， 于 冰 箱 中 保 存 。314 0.1%胱氨酸溶液：称取 1 gL胱氨酸于小烧杯中。加 20 mL 水，缓慢加入经约 510 mL 盐酸，直至其完全溶 解，加水稀释至 1 L，加少许甲苯盖于溶中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901201 实施123911990液 表 面 。315 酵母补充液：称取 100 g 酵母提取物干 粉于 500 mL 水中、称取 150 g乙酸铅于 500 mL 水中。 将两溶液混合 ， 以氢
6、氧化铵调节 pH 至酚酞量红色 （取少许 溶 液 检 验 ） 。 离 心 或 用 布 氏 漏 斗 过 滤 ， 滤 液 用 冰 乙 酸 调 节 pH 至 5.5。 通 入 硫 化 氢直至不生沉淀。 过滤， 通空气于滤液 中， 以排除多余的硫化氢。 加少许甲苯盖 于 溶 液 表 面 ， 于 冰 箱 中 保 存 。316 甲盐溶液：称取 25 g 磷酸氢 二钾和 25 g 磷酸二氢钾，加水溶解，并稀释 至 500 mL。 加 放 少 许 甲 苯 以 保 存 之 。3 17 乙 盐 溶 液 ： 称 取 10 g 硫 酸 镁 （ MgSO47H2） ， 0.5 g 硫 酸 亚 铁 （ FeSO47H2O
7、）和 0.5 g 硫酸锰（MnSO 44H2O） ，加水溶解，并稀释至 500 mL，加少许甲苯以保存 之 。318 基本培养储备液：将下列试剂混合于 500 mL 烧杯中，加水至 450 mL，用 1 mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 调 节 pH 至 6.8， 用 水 稀 释 至 500 mL。碱 处 理 蛋 白 胨0.1%胱 氨 酸 溶 液 酵 母 补 充 液 甲盐 溶 液 乙 盐 溶液 无 水 葡 萄 糖100 mL100 mL20101010mLmL mL g319 琼脂培养基：将下列试剂混合于 250 mL 三角瓶中，加水至 100 mL，于水浴上煮至琼脂完全溶化，用 1 mol
8、/L 盐酸趁热 调节 pH 至 6.8。尽快倒入试管中，每管 35 mL， 塞上棉塞，于高压锅内在 5.9104Pa（10 lb/in2）压力下灭 菌 15 min， 取 出 后 直 立 试 管 ， 冷 至 室 温 ， 于 冰 箱 中 保 存 。无 水 葡 萄 糖乙 酸 钠 （ NaAc3H2O） 蛋 白 胨 酵 母 提 取 物 干粉 甲 盐 溶 液乙 盐 溶 液 琼 脂1 g1.70.80.20.20.21.2gg g mL mL g320 0.04%溴甲酚绿指示剂：称取 0.1 g 溴甲酚绿于小研钵中，加 1.4 mL 0.1mol/L 氢 氧 化 钠 溶 液 研 磨 ， 加 少 许 水
9、， 继 续 研 钵 磨 。 用 水 稀 释 至 250 mL。3 21 0.04%溴 麝 香 草 酚 蓝 指 示 剂 ： 称 取 0.1 g 溴 麝 香 草 酚 蓝 于 小 研 钵 中 ， 加1.6 mL 和 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液研磨。加少许水，继续研磨，直至完全溶解，用 水 稀 释 至 250 mL。4 仪 器 与 设 备4 14 24 34 44 5实 验 室 常 用 设 备 。电 热 恒 温 培 养 箱 。 离 心 沉 淀 机 。 液体 快 速 混 合 器 。 离 压 消 毒 锅 。5 菌 种 的 制 备 与 保 存中华人民共和国卫生部 19900319 批准 1990120
10、1 实施12391199051 储备菌种的制备：以 LC纯 菌种接入 2 个或多个琼脂培养基管中。在370.5恒温培养箱中保温 1624 h。贮于冰箱内，至多不超过 2 周，最好每周移种一次。 保存数周以上的储备菌种， 不 能立即用于制备接种液， 一定要在使 用 前 每 天 移 种 一 次 ， 连 续 2 3 d 方 可 使 用 ， 否 则 生 长 不 好 。52 种子培养液的制备：取 5 mL 核 黄素标准使用液和 5 mL 基本培养储备液于15 mL 离心管混匀，塞上棉塞，于高压锅内在 6.9104Pa（10 lb/in2）压力下灭菌 15 min。 每 次 可 制 备 2 4 管 。6
11、操 作 步 骤因 核 黄 素 易 被 日 光 和 紫 外 线 破 坏 ， 故 一 切 操 作 要 在 暗 室 内 进 行 。6 1 接种液的制备： 使用 前一天， 将菌种由储备菌种管中移入已消毒的种子培养液中， 同时制作二管。 在 370.5保温 1624 h。 取出后离心 10 min（3000rpm） ， 以 无 菌 操 作 方 法 倾 去 上 部 液 体 ， 用 已 消 毒 的 生 理 盐 水 淋 洗 二 次 ， 再 加 10 mL 消毒生理盐水， 在液体快速混合器上振摇试管， 使菌种成混悬体。 将此液倾入已 消 毒 的 注 射 器 内 ， 立 即 使 用 。6 2 样 品 的 制 备6
12、 2 1 将 样 品 用 磨 粉 机 、 研 钵 磨 成 粉 末 或 用 打 碎 机 打 成 匀 浆 。622 称取约含 510 ug 的核黄 素样品（谷类约 10 g，干豆类约 4 g，肉类约 5 g） ，加入 50 mL0.1 mol/L 盐酸溶液，混匀。置于高压锅内，在 10.3104Pa（ 15 lb/in2） 压 力 下 水 解 30 min。623 冷至室温，用 1 mol/L 氢氧化钠溶液调节至 4.6(取少许水解液，用溴甲 酚 绿 检 验 ， 溶 液 呈 草 绿 色 即 可 )。624 加入淀粉酶或木瓜蛋白酶，每克样品加入 20 mg 酶。在 40恒温箱中过 夜 ， 大 约 1
13、6 h。625 冷至室温，加水稀释到 100 mL：过滤。对于脂肪量高的食物，可用乙醚 提 取 ， 以 除 去 脂 肪 。6 3 标 准 管 的 制 备两组试管中管各加核黄素标准使用液 0.1、 0.5、 1.0、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0mL， 每 管 加 水 至 5 mL， 再 每 管 加 5 mL 基 本 培 养 储 备 液 混 匀 。6 4 样 品 的 制 备641 吸取样品溶液 510 mL，置于 25 mL 具塞试管中，用 0.1 mol/L 氢氧化 钠 调 节 pH 至 6.8（ 取 少 许 溶 液 ， 用 溴 麝 香 草 酚 蓝 检 验 ） ， 加 水 稀 释 至
14、刻 度 。642 取两组试管，各加（6.4.1）样品稀释 液 1、2、3、4 mL，每管加水至5 mL， 每 管 再 加 5 mL 基 本 培 养 储 备 液 混 匀 。6 5 灭菌： 将以上样品管和标准管全部塞上棉塞， 置于高压锅内， 在 6.9104Pa（ 10 lb/in2） 压 力 下 灭 菌 15 min。6 6 接 种 和 培 养6 6 1 待 试 管 冷 至 室 温 ， 在 无 菌 操 作 条 件 下 接 种 ， 每 管 加 一 滴 接 种 液 （ 6.1） ，接 种 时 注 射 器 针 头 不 要 碰 试 客 壁 ， 要 使 接 种 液 直 接 滴 在 培 养 液 内 。662
15、 置于 370.5恒温箱中培 养约 72 h，培养时每管必须在同一温度。培养时间可延长 18 h 或减少 12 h。必要时可在冰箱内保存一夜再滴定。若用混浊 度 测 定 法 ： 以 培 养 18 24 h 为 宜 。6 7 滴 定将试管中培养液倒入 50 mL 三角瓶中，加 0.001%溴麝香草酚蓝溶液 5 mL，中华人民共和国卫生部 19900319 批准 19901201 实施123911990分二次淋洗试管， 洗液倒至该三角瓶中， 以 0.1 mol/L 氢氧化钠溶液滴定， 终点呈绿色。以第一瓶的滴定终点作为变色参照瓶。 约 30 min 后再换一参照瓶，因 溶 液 放 置 过 久 颜
16、色 变 浅 。6 8 用标准核黄素溶液的不同浓度为横坐标及在 滴定时所需 0.1 mol/L 氢氧化钠 的 毫 升 数 为 纵 坐 标 。 绘 制 标 准 曲 线 。6 9 计 算X 1 = c V 100 （ 1） F m 1000式 中 ： X1样 品 中 核 黄 素 含 量 ， mg/100g；c以 曲 线 查 得 每 毫 升 试 样 中 核 黄 素 含 量 ， ug/mL； V样 品 水 解 液 定 容 总 体 积 ， mL； F试 样 液 的稀 释 倍 数 ；m试 样 质 量 ， g；100 样 品 含 量 由 ug/g 换 算 成 mg/100 g 的 系 数 。10007 结 果 的 允 许 误 差同 一 实 验 室 平 行 测 定 或 重
