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1、Southern Blot 操作流程1、哺乳动物基因组 DNA 的提取（或用 OMEGA 试剂盒 E.Z.N.A.TMTissue DNA Kit）1、 取约 30mg 样品，加入 600 ul SNET，再加入 12 ul（20.2mg/ml ）的蛋白酶K，使蛋白酶 K 的终浓度为 400ug/ml；2、 55振荡过夜；3、 加入 0.6 ul RNaseA，室温下孵育 10 min，后置于 65 10 min；4、 加入 300 ul Tris 饱和酚，288 ul 氯仿和 12 ul 异戊醇，室温下振荡 30 min；5、 17,000 g 离心 5min，转移上层水相（600 ul）至
2、一新的离心管；6、 加入等体积（600 ul）的异丙醇沉淀 DNA，于 4下 13,250 g 离心 15 min；7、 小心除去异丙醇，加入 1 ml 70%的乙醇。离心 5 min 后除去乙醇，室温下干燥 1520 min；8、 加入 100 ul TE，使核酸沉淀溶解。一、 酶切1、 拷贝数的计算哺乳动物基因组全长3.010 9个碱基对，按插入基因单拷贝计算如下： gplasmidofsbpDNAofInserti 1010.392、 酶切体系基因组 DNA 10 ug10*Buffer 10 ul酶(10U/ul) 10 ulTotal 100 ul3、 混合后置于适宜酶切温度进行酶切
3、反应；4、 对酶切产物进行纯化，用 30 ul TE 洗脱；5、 制备 1%浓度的琼脂糖凝胶（不加 EB） ；6、 将纯化后的酶切产物敞开盖子于 70放置 15 min，以除尽残留乙醇和消除酶切后产生的粘性末端；7、 电泳：1v/cm。二、 转膜1、 碱变性：把胶条转移到含碱变性液的器皿中，摇床处理 15 min；重复一次；2、 中和：倒出器皿中的碱变性液，加入中和液，摇床处理 15 min；重复一次；3、 倒出中和液，加入 20SSC，摇床处理 15 min；4、 转膜：1） 在一干净的容器中放入一包吸水纸，倒入 20SSC，浸湿；2） 放上一张与胶条大小相当的 sigma 3M 滤纸，倒上
4、一层 20SSC，防止产生气泡；3） 将预先剪裁好的尼龙膜放入 ddH2O 中充分浸润 2 分钟；4） 小心把胶条铺在滤纸上面，用玻璃棒擀平，赶走气泡；5） 往胶上倒上一层 20SSC，将尼龙膜铺在胶条上，再向上倒上一层20SSC；6） 再放上一张与胶条大小相当的 sigma 3M 滤纸；7） 用保鲜膜把胶条四周封上，在上面压上一包吸水纸，再用一个约 250mg 的物体压在吸水纸上面；8） 转膜过夜；5、 固定将膜放在用 10SSC 浸湿的滤纸上面，使含 DNA 面朝上，放入紫外交联仪中，以 1.5J，254n，2.5min 的程序将 DNA 固定在尼龙膜上。三、 杂交1、 标记探针：可用随机
5、引物法或 PCR 方法标记探针；2、 将尼龙膜有 DNA 的一面朝内，卷成筒状放入杂交管中，加入 10 ml 经预热至 50的 DIG Easy Hyb，于 50 预杂交 30 min；3、 取 10 ul 经标记的探针，热水浴 5 min 变性，然后迅速放入冰水混合物中；4、 将变性后的探针加入 4 ml 预热的 DIG Easy Hyb 中，混匀，并防止气泡的产生（气泡会产生背景） ；5、 倒出预杂交液，加入含探针的杂交液，杂交 4h 或过夜。6、 杂交温度的计算Tm=49.82+0.41（%G+C）-（600/I）I=length of hybrid in base pairsTopt=
6、 Tm-20 to 25四、 洗膜1、 室温下用 W1 洗液洗 5min，重复一次；2、 68下用 W2 洗液洗 15min，重复一次；3、 将膜用 Washing Buffer 浸润 5min；4、 2550下，用 100ml Blocking Solution 孵育 30min，保持摇动；5、 2550下，用 20ml Antibody Solution 孵育 30min，保持摇动；6、 用 100ml Washing Buffer 洗 15min，重复一次；7、 用 20ml Detection Buffer 平衡 5min；8、 将膜放入杂交袋中，使含 DNA 面朝上，滴加 1ml C
7、SPD ready-to-use，将杂交袋合上，并赶走气泡，于 1525孵育 5min；9、 挤出多余的液体，将潮湿的膜置于 37孵育 10min，以增强发光反应。五、 显影直接用成像系统成像。 DNA 提取的溶液配制1.Tris-HCl (1mol/L ；PH 8.0) 用 800ml 蒸馏水溶解 12.1g Tris 碱，加浓 HCl（约 42ml）调 PH 至 8.0，应使溶液冷却至室温后，方可最后调定 PH 值，加水定容至 1L。高压灭菌。*如果溶液出现黄色，应予以丢弃，并使用质量更好的 Tris。2.EDTA（0.5 mol/L ；PH 8.0）186.1 g EDTANa2H2O
8、加入 800ml 水中，用 NaOH 调节 PH 至 8.0（约需20gNaOH） ，定容至 1L，高压灭菌。*EDTANa 需在 PH 接近 8.0 时才会溶解。3.NaCl (5 mol/L)292g NaCl 加入 800ml 水中，定容至 1L，高压灭菌。4.SDS（20% ，m/v ）十二烷基磺酸钠200g SDS 加入 900ml 水中，加热到 68有助于溶解，定容至 1L。*无须灭菌，不要蒸汽高压。5.SNET20 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)5 mmol/L EDTA(PH 8.0)400 mmol/L NaCl1%(m/v) SDS6.TE(PH 8.0)1
9、00 mmol/L Tris-HCl(PH 8.0)10 mmol/L EDTA(PH 8.0)Southern 缓冲液配制（修正版）1.Washing buffer：分子量 1L 体系 5L 体系0.1M 马来酸（116.07）： 11.607g 58.035g0.15M NaCl （58.45）： 8.768g 43.838g用 NaOH 调 pH 至 7.5 （20）灭菌0.3% Tween20： 3ml 15ml2.Maleic acid buffer：分子量 1L 体系 5L 体系0.1M 马来酸（116.07）： 11.607g 58.035g0.15M NaCl （58.45）：
10、 8.768g 43.838g用 NaOH 调 pH 至 7.5（20）灭菌3.Detection buffer:分子量 1L 体系 5L 体系0.1M TRIS Base（121.14）： 12.114g 60.57g0.1M NaCl （58.45）： 5.845g 29.225g用 HCl 调 pH 至 9.5（20） 灭菌4. 10% SDS1L 体系SDS 溶液 100g SDS用 0.45um 滤器进行灭菌（不能进行高温灭菌）5. 20*SSC分子量 1L 体系 3M NaCl （58.45）： 175.3g0.3M 柠檬酸钠（294.10）： 88.2g用 HCL 调 pH 至 7.0灭菌6.碱变性液分子量 1L 体系0.5M NaOH（40.0） 20g1.5M NaCl （58.45 ） 87.68g不需灭菌7.中和液分子量 1L 体系 0.5M Tris 121.14 60.57g1.5M Nacl 58.44 87.66g
