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1、中药对细菌抑菌作用的体外实验方法学研究实用检验医师杂志 20l1 年 3 月第 3 卷第 1 期ChineseJournatofClinicalPathologist,March20l1Vol-3,No.1中药对细菌抑菌作用的体外实验方法学研究陶庆春作者单位:100029 北京市,北京中医药大学第三附属医院检验科当今社会科技飞速发展,医疗手段和药物层出不穷.自青霉素发明以来感染性疾病得到了较好的控制,但是如今抗生素的不规范使用,致使多重耐药细菌出现.虽然抗生素在不断地更新换代,但还是不能完全控制由耐药性细菌所致的疾病.再者新一代抗生素价格昂贵,增加了患者的经济负担.中药在控制耐药性细菌感染方面
2、具有其独特的优势,中药价格较低,毒副作用小,且很少有耐药现象出现.中药对细菌抑菌作用的体外实验方法有很多,现将几种主要方法列举如下.1 中药煎剂直接体外抑菌法这种方法应用最普遍,用此方法进行研究的药物也最多,主要有:中型滇丁香浸膏 ,竹板,黄连,黄芩,连翘,射干,防风,黄柏,败酱草,鱼腥草,大黄,千里光,封子,丹皮,白芍,九节茶,夏枯草,厚朴,大青叶,蒲公英,金银花,连翘,地丁,瓜蒌,龙胆草,蚤休,栀子,板蓝根,知母,秦艽,四季青,马齿苋,生晒参,生葱,蒜,白薇,紫草,山豆根,苦参,芙蓉叶等.直接体外抑菌法研究过的耐药性细菌(主要来源于临床)有:肺炎链球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methi
3、cillinresistantStaphylococcuso2treus,MRSA),凝固酶阴性葡萄球菌,大肠埃希菌,肺炎克雷伯菌等.1.1 稀释法1.1.1 肉汤稀释法1.1.1.1 常量稀释法取无菌管 12 支,每管加入水解酪蛋白肉汤 2ml.在第 1 管中加入药物 2m1 混匀,连续倍比稀释至第 11 管,并从第 11 管中吸取 2ml 弃去,第 12 管为不含药物的生长对照.在每管内加入制备好的接种物各 100Ixl,使得每管最终菌液浓度为 5x10CFU,mL,注意稀释菌液于 15min内完成.当生长对照管生长状况良好,同时确定接种物未被污染后,肉眼观察药物最低浓度无细菌生长者,即为
4、受试菌的最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)1.若需要测定最小杀菌浓度(minimalbactericidalconcentration,MBC)则把无菌生长的试管中吸取 0.1m1 加到冷却至 50的MH 琼脂混合倾注平板,将前述稀释的原接种液倒在平板上,培养 4872h 后计数菌落,即可得到抗菌药物的 MBC.李建志等闭采用常量稀释法研究 7 种中草药对金黄色葡萄球菌(Staphylococcustureus,SA), 肺炎链球菌,铜绿假单胞菌,白色念珠菌等 13 种菌株的抑菌作用,结果表明 7 种中药对各菌株生长均有不同程度的抑制作用.1.
5、1.1.2 微量稀释法方法同常量稀释法,先将药物作稀释,再配制 0.5 麦氏浓度菌液,用蒸馏水或生理盐水稀释菌液,使得最终菌液浓度为 5x10CFU/mL,每孔含 0.1ml.35培养18h 后借助比浊计判别是否有细菌生长.若需要测定 MBC,方法同常量稀释法.尹洪萍等31 将 10 种中药药液用 LuriaBertani(LB)液体培养基做对倍连续稀释成系列浓度,用微量加样器依次在微孔板各孔内加入稀释药液和菌液各 8Ol,设不加药对照.震荡混匀,置于 5%-8%CO 孵箱 ,35培养 18h 后,借助比浊计判别是否有细菌生长.分别从每孔取两接种环接种在 MH琼脂平板,依前法再次孵育 18h
6、后观察是否有细菌生长,记录各中药的 MIC,并计算 MIC50 及 MIC 的药物浓度,从而观察各种中药对耐药性肺炎链球菌的抑菌作用.彭青等41 用微量稀释法研究 6 种中药单体对 MRSA 的抗菌作用.结果表明6 种中药单体对 MRSA 有不同程度的抑制作用,其中大黄酸抑菌作用最强.1.1.2 琼脂稀释法琼脂稀释法是将药物混匀于琼脂培养基中,配制含不同浓度的药物平板,使用多点接种器接种细菌,经孵育后观察细菌生长情况,以抑制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测得 MIC.药液稀释:排列无菌试管 1O 支,于 2-10 支管中加无菌蒸馏水 10ml,取中药提取物 20d,于第 1 管中加入 10ml
7、,第 2 管中加入 10ml.于第 2 管混合后取出 10ml,加入第 3管,再混合后取 1Om1 加入第 4 管,如此连续稀释至第 9 管取出 10ml 弃掉,第 10 管的无菌蒸馏水作对照.含药平板制备:将已溶化的无菌 MH 琼脂 900ml,分装于 10 瓶,每瓶 9Om1,将第 1 管中 10ml 药物倒人含 90ml 培养基的瓶中,混匀后倾注平板.第 2 管及以后的平板制备同第 1 管,凝固后备用,整个制备过程均为无菌操作.经过称重,计算出每组每 ml 培养基中提取物的干重量.2?实崩检验医师杂志 2011 年 3 月第 3 卷第 1 期ChineseJournalofClinica
8、lPatholozist,March2011,Vo1.3,No中药抑菌试验:将 0.5 麦氏浓度菌液稀释 10 倍,用多点接种仪分别取菌液点种于含不同药物浓度的琼脂平板上,于35培养 l824h,观察 MIC,并统汁出 MIC 和 MIC 的药物浓度和累积抑菌百分率51.田健等 I 用琼脂稀释法研究黄柏等几种中草药对葡萄球菌的体外抗菌作用,研究表明黄柏等几种中药对 SA 和表皮葡萄球菌均有很好的抑菌作用,而且黄柏,地榆,紫草 3 种药物以一定比例混合后同样具有很好的抑菌效果.李仲兴等/I同样用此方法研究连翘对 SA 及表皮葡萄球菌的体外抗菌活性,发观有较好的体外抗菌效果.连续稀释法测出的抗菌效
9、力比扩散法强,原因可能是与f1l 药成分在琼脂中的渗透性较好有关.琼脂扩散法的优点是可以在同一个平板上同时做多个菌株的 MIC 测定,结果可靠,易发现污染菌.缺点是费时费力,中药浓度不好控制.对革兰阴性菌而言,微量肉汤稀释法测得的 MIC 与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度(1 孔或 2 倍). 但这两种方法易受培养基成分和 PH 值,接种菌浓度,孵育时间和温度,终点判读的误差等影响.1.2 改良稀释法由于中草药为天然药物,相对于抗生素来说用量大,药性弱,而且自身有浓度和色度,这就使稀释法存结果观察 j:需要观察浓度及管底或孔底的细菌沉积,需要借助其他手段进行终点判读.赵晓丹等 I研
10、究借助比色法来测定抑菌活性,即除了实验组外,另取一稀释系列,不接种仟何细菌作为空白对照.将培养后的培养物与空白对照用分光光度计进行比色,以相同浓度下两者浊度完全相同为准,即培养基中完全没有细菌生长的最低浓度为 MIC.1.3 扩散法1.3.1 挖孔法实验用细菌在 LB 液体培养基中培养 18h,取少量菌液经稀释后取 0.1ml 涂布于普通琼脂培养基上 ,待琼脂表面稍下后用打孔器挖出直径约 6mill 的孔,两孔间距约 20mm,然后将 0.05ml 中药提取物加于琼脂孔内,并在相邻孔内加入一定量用于检测药物敏感性的抗生素(浓度及用量参照药敏试验方法),培养 18h 后观察.中药孔及抗生素孔周围
11、细菌生长,但两孔间出现细菌不生长的区域,视为抑制剂有效;两孔剧围及孑 L 间细菌均匀生长成片状,视为中药提取物对细菌耐药性无抑制作用 f.李洪涛等”曾用琼脂平板.r-fL 法研究 16 种中西药及复方制剂埘奶牛子宫内膜炎主要致病菌的体外抑菌作用,结果发现黄连,黄芩,大黄的抑菌效果较好,一组中西药复方抑菌效果明显.1.3.2 药敏纸片法中药纸片的制备方法为取优质滤纸若f 张,用打孔器制备纸片,高压灭菌后 ,取上述纸片放入无菌玻璃平皿内,每片加中药 30ul,置 37温箱内温干备用.用已温 f 的中药纸片代替抗生素纸片 ,其他操作按 KB 法i 进行,即用无菌棉拭子蘸取 0.5 麦氏浓度菌液,在管
12、内壁将多余的菌液旋转挤去后,在琼脂表面均匀涂抹接种 3 次,每次旋转平板 60.,最后沿平板内缘涂抹一周.将平板在室温下下燥35nlin,用纸片分器或无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面,各纸片巾心相距15nlnl, 置 35温箱孵育 1618h 后读取结果.钱红等 II 采用 KB 法进行 L 卜 I 药_方剂 Bingdeling 联合青霉素以及内酰胺类抗生素(阿莫西林 ),氨基糖苷类抗生素(庆大霉素),大环内酯类抗生素 (罗红霉素)等抗菌药体外对 SA的药敏试验.结果表明,体外 Bingdeling 联合青霉素,阿莫四林,庆大霉素,罗红霉素应用,对 SA 有协同增强抗菌作用.1.3.3 杯碟
13、法又称小杯法或平皿法,牛津大学 Abraham首创.小杯内的药物在接种有细菌的平皿培养基中扩散,使杯子周围产生抑制细菌生长的抑菌圈,其大小与药物作用大小成正比.内径 90mm 的平板,注入高压灭菌后水浴平衡至50的水解酪蛋白琼脂 20ml 作为底层并使其凝,取适量培养基,加入适量的菌悬液混匀,每平皿 5ml 作为均层 .一芏供试菌的双层琼脂平板上,按间隔一致的距离置小铡管即中津小杯,定量加入药液.张钟允等用此方法研究中药安福雷组方颗粒剂对奶牛乳房炎主要致病菌的体外抑菌作用,其中 SA 和表皮葡萄球菌对安福雷颗粒剂极敏,停乳链球菌对其高敏,大肠朴菌对其中敏,结果表明安福雷组方颗粒剂对奶牛乳房炎有
14、较好的体外抑菌效果.以上 3 种扩散方法中,KB 法所得抑菌圈较规则,易测量,但纸片的质量,含药量和保存方式等对结果都有影响.杯碟法要求操作精准,若有滑动则所得抑菌圈不规则.t-/L 法则弥补了杯碟法的缺点.1.4 菌落计数法将不同浓度的药物与菌液混合作用一定时间后,生 k 对照分别均匀倒在 MH 培养基上,35培养24h,观察细菌生长状况,分别计数菌落数,按下列公式汁算抑菌率:抑菌率(%)=(对照nL 菌落数一实验皿菌落数)/x,j 旦皿菌落数 xlOO%Il.也口 J 以通过菌落计数和测定吸光度值,做出吸光度一菌数标准曲线.以样品液测得吸光度值(A)查找对应的菌数,通过添加中药和不加中药的
15、菌液浓度变化可以得到该样品液体的抑菌效果,抑菌率表示如下:抑菌率(%)=(对照菌浓度一含药菌浓度)/,l- 照菌浓度 x100%II.钱红等 1121 用菌落形成计数方法,观察 Bingdeling 对临床常见 4 种细菌:SA,大肠埃希菌,沙门菌,铜绿假单胞菌的体外抑菌作用,结果发现中药方刹 Bingdeling 体外对 SA 的生长具有非常明显的抑制作用.2 含药血清体外抑菌法含药血清制备为实验动物 Wistar 大鼠,巾药灌胃 3d,末2011 年 3 月第 3 卷第 l 期 ChineseJournalofClinicalPathologist,March20ll,Vo1.3,No.1
16、次给药后 1h,颈动脉无菌手法采血,离心并将分离的含药血清混合,56,30min 灭活,一 6O保存备用.同 j 一法以 0.9%NaC1 注射液,双黄连口服液灌胃 ,制备阴性对照和阳性对照皿清.采用 MH 肉汤培养基对含药血清进行梯度稀释.菌液制备:将受试菌接种于血琼脂平皿 ,37,孵育 1824h,次日,取菌苫适量于 MH 肉汤中,37,68h 孵育后,以适量生理盐水调整菌液浓度至 1xl0CFU/mL2x10CFU/mI(0.5 麦氏单位) 备用.体外抑菌试验:将受试菌以生理盐水调整菌液浓度至10CFU/mL,取 50ul 加入含药血清 lml 中,使试验体系中细菌终浓度为 5x10CFU/mL,37,孵育 1824h,观察出现澄清试管(即受试菌未生长,含药血清有抑菌作用 )为 MICll.3 噻唑蓝 lthiazolylbluetetrazoliumbromide,MIT)比色法MIT 比色法原理:四甲基偶氮唑盐分子结构中的四氮唑环可在活细胞线粒体的琥珀酸
