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1、我们实验室用的银染方法1.50%甲醇浸泡 15 分钟(置于摇摆床上, 以下省略,本步骤两次,每 15 分钟更换一次)2.10%甲醇浸泡 10 分钟 3.水漂洗 3 次, 每次数秒4.2M DTT 溶液浸泡 20 分钟5.0.1%硝酸银溶液浸泡 20 分钟6.水漂洗 3 次, 每次不超过 15 秒(每次约 150ML)7.显色液漂洗 3 次 ,每次不超过 15 秒( 每次约 100ML)8.显色液浸泡显色至看到目的蛋白带( 约 200ML)9.10G 柠檬酸定影显色液:15G 无水碳酸钠溶于 500ml 水, 用前加入 250L福尔马林搅拌均匀水用双蒸水就可以,纯度越高越好, 其他试剂用分析纯,
2、据书上说甲醇用化学纯的比分析纯更灵敏此方法出自冷泉港蛋白质技术指南(实际上是其蛋白质技术会议的总结)灵敏度稍低于分子克隆上老方法, 但是非常方便,也比其他方法快速, 只需要 1.5 小时,我染出来的胶非常漂亮,有需要的话可以上传给大家看看一般来说，高背景是由于杂质产生的，银染的水质很重要，最好要用去离子水或双蒸水，装胶的器皿也一定要洗得很干净。固定、银染之后均需充分的漂洗。其实银染就是银镜反应，可能是你的样品浓度高，所以白了，浓度更高还会变成一条能反光的带。固定时间不需加长，我有时来不及还减少固定时间，银染关键是器皿和溶液干净，显色前胶一定要漂干净大板本来效果就差点，浓度越大，条带形状越差，这
3、也很正常，银染薄点的胶效果要好些，因为染的是表面的蛋白1. 取下凝胶,蒸馏水冼胶 30 秒.2. 0.1% 硝酸银染色 10 分钟.3. 弃去染色液,蒸馏水洗胶 1 分钟.4.显色液显色 15 秒, 换用新的显色液,显清条带为止.显色液配方: 10 克氢氧化钠+0.2 克碳酸钠+2m 甲醛溶液,定溶到 500ml.这个染色方法挺好的,我用过. 注意染色时间不能长.材料没什么要求，玻璃会更好一点，但不好搞到，我们是见到什么大小合适就用什么。液体的量一般是胶体积的 5 倍，比如 13130.1cm 的胶，用一百 ml 一定够，80 也行。我的经验是：1.取下凝胶用去离子水冼胶 30 秒三次，2.0
4、.1% 硝酸银染色 10 分钟.3.弃去染色液,蒸馏水洗胶 1 分钟（换 2 次去离子水）4.显色液显色 15 秒, 换用新的显色液,显清条带为止.不要试图将所有的条带都显出来，要求越高可能导致背景就深，5.染色后要用固定液（冰乙酸）终止染色，6.固定 3 分钟后再用去离子水洗涤 2 遍（整个试验比较费去离子水） 。我的做法是这样的，染色效果还可以10%的乙醇固定 10 分钟，ddH2O 洗一次， 2 分钟。1%的硝酸脱色 4 分钟，ddH2O 洗两次，每次 1 分钟。0.2%AgNO3 染色 20 分钟，ddH2O 洗三次，每次 1 分钟。NaCO3-甲醛显色至条带出现。我的感觉是乙醇和硝酸
5、重复使用的次数不要太多，这样效果不好，NaCO3-甲醛得质量很关键，我们有一次换了试剂，效果非常差银染法分以下几个程序： 1、固定 2、敏化 3、银育 4、显影 5、停显 此外，其间还有数步的漂洗程序。 在你的银染方法中没有敏化过程，不过也中可以的，只是灵敏度会下降。 银染法还可分为碱性银染和酸性银染法，为何称为酸法？是指硝酸银这一强酸弱碱盐溶液因水解呈酸性而得名？ 何为二胺类银染法？俺知道有银铵法，即在硝酸银溶液中加入氢氧化钠，银离子在氢氧化钠的作用下生成氢氧化银沉淀，后加入过量氨水，形成可溶的银铵络和物，而后者经甲醛还原为单质银颗粒。二胺法可是指此络和物为二铵盐？您这里的“胺”应为“铵”。
6、 至于敏化作用，众说纷纭，且银染的灵敏度相当高，对常规分子生物学实验已是牛刀小用，敏化俺认为还是不用的好，因为对背景不利。 对于银染的研究在 80 年代的 electrophoresis 杂志中多有报道。 小经验：为便于控制显影速度，得到最佳的信噪比，银染的显影液温度不要过高，以 10 度左右为宜，高则易显影过度，背景深，低则显影时间长。 请兔子兄将您的大作上传，大家学习学习。有人建议在显色液中加 0.02%的硫代硫酸钠来降低背景，我还未实践，不知牛兄和兔兄有无此经验？还有灌胶用的玻璃板是否已经洗干净。染色液:1g 硝酸银、1 升水显影液：20g 氢氧化钠、 0.4g 碳酸钠、 4ml 甲醛、
7、1 升水步骤：1、将要染的胶板用水清洗 1015s2、放入染色液中摇床轻摇 810min3、用水清洗 1015s，再加入少许显影液摇 1015s4、放入显影液中摇床轻摇 5min 左右直至条带清晰。此种方法染出的胶底色淡黄，带清晰。不足之处就是不易保存，在胶干透之前最好拍照或扫描。固定:% 乙醇+. % 冰醋酸 分钟染色: . % gNO3 + 10% 乙醇+0.5% 冰醋酸 12 分钟清水漂洗 10-15s 显色： 3% NaOH + 0.5% 甲醛（用时加）10min 左右对比以后觉得比那个用 Na2CO3 显色的方法好多了，无论是花费的时间还是银染的效果。呵，传张胶的照片佐证啊！顺便请教
8、一下各位，为什么我跑电泳的时候靠近电极的一端总是比另一端慢呢？电压太高？你这样显色是不规范的，具体显色步骤如下： 1.2.5.3 银染 （1）固定：将粘胶的玻璃板（胶面向上）置于固定/终止液（10%冰醋酸溶液），振荡 20 分钟左右至指示剂颜色脱掉为止。 （2）清洗：用蒸馏水振荡洗涤凝胶 3 次，每次 5 分钟，凝胶板从水中取出后，竖直控水 15 秒。 （3）染色：将胶板移至染色液（1gAgNO 3 溶于 1L 水，加入 37甲醛 1.5ml（用时加），轻摇 35分钟。 （4）显影：将染色后的凝胶板放入蒸馏水中 2-3 秒，迅速取出并竖直控水，随后把胶板放入预冷的显影液中（30g 无水 Na2
9、CO3 溶于 1L 水中，放在 4预冷，使用时加入 1.5ml 37甲醛和 200ul 硫代硫酸钠（10mg/ml）。振荡显影至条带颜色深浅合适。 （5）定影：将胶板放入第一步反应的固定/终止液中，轻摇 7-8 分钟。 （6）清洗：用蒸馏水清洗几分钟，取出晾干。 （7）扫描胶，找出差异带，并进行条带统计甲醛在银染当中的作用，求教各位大侠在此发表自己的一点拙见：，关于甲醛在银染中的作用：在显色步骤（developing)中：甲醛的作用是充当还原剂，反应式如下：- 2e-，失电子而g+ 得电子在银染步骤中（impregnation)中，其作用主要是增敏原理偶不是非常清楚，应该是加速与蛋白质结合的g
10、+的还原。有文献讲到过（很老的了，找不到了，应该是 ELECTROPHORESIS 上年代的文章，上世纪），低浓度甲醛与蛋白质的结合是可逆的，其并不阻止蛋白质氨基酸残基与g+结合；而高浓度甲醛与蛋白质的结合不可逆，而且造成蛋白质广范围交联（是不是有点类似于戊二醛？），并抑制 Ag+与蛋白质的结合，同时甲醛不能被释放出来用于还原。至于究竟具体是什么机制造成与质谱不兼容，偶也不知道（不好意思的说）想说的一点是，既然两种方法都已经证明 optimized for maldi-tof，那么应该都没有问题，如果您还有狐疑，那么，用 amersham 的方法吧，毕竟人的心态都更倾向于保险硫代硫酸钠：增敏时
11、形成潜像硝酸银：形成显色的像素点甲醛：还原剂，将银离子还原为零价银。终止液：一种配方中的 EDTA 将银螯合，另一种配方的 HAc 改变 pH，使甲醛在酸性 pH 下的还原能力降低，（个人经验：HAc 终止反应不是很彻底，有一次我用 HAc 终止反应，但没有更换 buffer，结果过夜放置后胶变黑了）一点看法，抛砖引玉。 一个高灵敏度的质谱相容性银染法这种方法不用戊二醛，所以是质谱相容的，而且由于甲醛用量很低，其质谱相容性高于其它的相容性银染方法；灵敏度可以与双胺法银染相近，但比双胺法稳定，基本上没有负染现象，值得一试！for 1mm SDS PAGE：固定：50% 甲醇， 5%乙酸 20mi
12、n醇洗：50% 甲醇 10min水洗：ddH2O 10min 敏化：0.02%硫代硫酸钠 1min水洗：ddH2O 21min银染：冰冷的 0.1%AgNO3 20min（4 ） （我是把它扔到冰箱里染的）水洗：ddH2O 21min显影：0.04% 37%甲醛，2%无水碳酸钠 显影至蛋白点清晰 这一步要注意在液体变黄时及时更换新鲜的溶液，一般要换四次左右，头几次很快，第一次可能只要几秒就黄了停显：5%乙酸保存：1%乙酸对于 1.5mm 的胶：固定：50% 甲醇， 5%乙酸 20min醇洗：50% 甲醇 10min水洗：ddH2O 210min 敏化：0.02%硫代硫酸钠 2min水洗：ddH
13、2O 31min银染：冰冷的 0.1%AgNO3 30min（4 ） （我是把它扔到冰箱里染的）水洗：ddH2O 31min显影：0.04% 37%甲醛，2%无水碳酸钠 显影至蛋白点清晰 约十分钟，期间注意及更换新鲜溶液，保持溶液不变黄！ 停显：5%乙酸保存：1%乙酸除了银染外，全过程均需摇动。是我用过最好的银染法，我用过双胺法，安玛西亚的方法，还有其它 的一些，安玛西亚的方法加戊二醛时的灵敏度只与此方法相当，约为考染的 50100 倍，胶体考染的 10 倍，锌负染的两倍。希望大家都能重视它，多试多使用我们实验银染的方法很简单，好象大家做的效果都很好！你也可以试试。1.50%的甲醇摇 30 分
14、钟2。5%的甲醇摇 10 分钟3.用水快速洗 3 次4.用 10 uMde DTT 浸泡 20 分钟5.用 0.1%的 AgNO3 浸泡 20 分钟6.用水快速洗 1 次。用显影液（取 15g 的无水 Naco3，溶于 500ml 水中，临用前加 250uml 的 37%的甲醛）洗 2 次，每次不超过 15 秒。7.在显影液中浸泡数分钟，直至蛋白带出现。8.加柠檬酸终止我用的是这种方法：1. Fix gel in 50% MeOH, 5% HAc for 20 mins.2. Wash gel in 50% MeOH for 10 mins.3. Wash gel in H2O for 2 h
15、rs.Additional washing over night will reduce backgroundstaining.4. Sensitize gel in 0.02% Na2S2O3 for 1 min.5. Wash gel in H2O for 1 min.6. Wash gel in H2O for 1 min.7. Incubate gel in cold 0.1% AgNO3 for 20 mins.8. Wash gel in H2O for 1 min.9. Change gel chamber10. Wash the gel in H2O for 1 min.11. Develop gel in 0.04% formalin, 2% Na2CO3Observe the color and change solution
