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1、1实验一 根系活性的测定 1原理：植物的根系能氧化吸附在根表面的 -萘胺，生成红色的 -羟基-1-奈胺，沉淀于有氧化力的根表面，使这部分根染成红色。根对 -萘胺氧化能力与其呼吸强度有密切关系，日本人相见、松中等人认为 -萘胺氧化的本质就是过氧化物酶的作用，该酶的活力愈强，对 -萘胺的氧化力也愈强，染色也愈深。所以，可以根据染色深浅定性的判断根的活力。-萘胺在酸性环境中与对氨基苯磺酸和亚硝酸盐作用生成红色的偶氮染料，可供比色测定 -奈胺含量。2.药品：（1） 40ppm（ug/ml）-萘胺溶液：精确称取 0.10g 分析纯 -萘胺，先用 2ml95%酒精溶解，加约 50ml 蒸馏水移入 100m
2、l 容量瓶中，然后稀释至刻度，保存于棕色瓶中，置于低温暗处保存。用前稀释 25 倍（40ml 稀释至 1000ml）即为 40ppm 溶液。（2） 对氨基苯磺酸溶液：称 1对氨基苯磺酸溶于 100ml30%乙酸（醋酸）中。（3） 100ppm 亚硝酸钠溶液：称 0.10g 亚硝酸钠溶于 1000ml 蒸馏水中。（4） 0.067mol/L pH7.0 磷酸缓冲液分子量 0.067mol PH7.0(1000ml 磷酸缓冲液)所需量（）a 2HPO4.2H2O 178.05 7.1184g a 2HPO4.12H2O 358.22 14.4004g KH2PO4 136.09 3.6292g a
3、 2HPO4.2H2O 7.1184g (或a 2HPO4.12H2O 14.4004g)+ KH2PO4 3.6292g 定容到1000ml 容量瓶中。3.方法与步骤：(1) -萘胺标准曲线的绘制：用 40ppm-萘胺溶液配制成 0、5、10、20、30、40ppm各浓度 -萘胺的配制：用 40ppm 溶液配制浓度 ppm 10ppm 20ppm 30ppm 40ppm40ppm-萘胺(ml) 5 10 20 30 40蒸馏水 35 30 20 10 0-萘胺标准曲线的绘制试管号 （对照） -萘胺(ml) （水） 磷酸缓冲液（ml） 蒸馏水（ml） 15 15 15 15 15 15对氨基苯
4、磺酸（ml） 100ppm 亚硝酸钠（ml） 混匀，置室温（2025 度）下分钟使之显色，最后加入蒸馏水，使整个容积为 25ml,摇匀，在 20-60 分钟内用 510nm 波长进行比色，以对照光密度为，读取光密度，以-萘胺含量作横坐标，光密度作纵坐标绘制标准曲线。(2) 将待测根系吸净吸干附着水称取 1g 放入 100ml 三角瓶中，加 40ppm 的 -萘胺溶液和磷酸缓冲液各 25ml，混匀。2(3) 静置 5-10 分钟后（根吸附以完毕） ，从瓶中取 2ml 溶液放入 25ml 容量瓶。将其余的溶液塞好瓶塞后，放在震荡器上，在 25下震荡 3-6 小时（如无震荡器时要在反应期间，定时的摇
5、动） ，反应时间完毕后，再取 2mL 溶液放入另一刻度试管，因为 -萘胺溶液会自动氧化，所以要同时做无根的同样操作的空白试验（根样最好用整根；用切碎的根，-萘胺溶液的氧化量会意外增加） 。(4) 在上述两次及空白试验所吸取的 2ml 测定液中，各加入 10ml 蒸馏水，混匀后再加入 1%对氨基苯磺酸 1ml 和 100ppm 的亚硝酸钠溶液 1ml，混匀，置于室温下 5 分钟使之显色，然后加入蒸馏水，使整个容积为 25ml，在 20-60 分钟内用 510nm 波长进行比色，读取光密度，由标准曲线查出 -萘胺含量。也可以将根系烘干，以干重计算根系活力（更为准确些） 。(5) 结果计算根系对 -
6、萘胺的生物氧化量 Y（ug.g -1.h-1）按下式进行计算Y=（A-B）-（C-D）*E/（t*W）式中：A- 第一次取液测定值（ug.ml -1） ，作为开始值，这是根表面氧化物质的氧化作用而不是根的酶促反应；B-第二次取液测定值，是根的酶促反应后（如 3 小时）剩余的 -萘胺浓度（ug.ml -1） 。A-B 即 -萘胺氧化总量；C-第一次空白测定值（ug.ml -1） ；D-第二次空白测定值；C-D 即 -萘胺自发氧化量；E-稀释倍数 24（48/2） （因从 48ml 中又取 2ml） ；t-3 小时；W-样品鲜重（也可以用干重计算） ；3实验二、 硝酸还原酶活性的测定 -活体法原理
7、：硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸（或对 -氨基苯磺酰胺）及 -萘胺（或萘基乙烯胺）在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在 540nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示。一般以每克鲜重含氮量表示，即以 ug.g-1.h-1 为单位。NR的测定可分为活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定。离体法复杂，但重复性较好。试剂1 亚硝酸钠标准溶液：准确称取分析纯 NaNO20.9857g 溶于去离子水后定容至 1 000ml，然后再吸取 5ml 定容至
8、1000ml，即为含亚硝态氮 1ug.ml-1 的标准液；2 0.1molpH7.5 的磷酸缓冲液： Na2HPO4.12H2O30.0905g 与 NaH2PO4.2H2O 2.4965g 加去离子水溶解后定容至 1 000ml；3 1%（W/V）溶液：1.0g 对氨基苯磺酸溶于 100ml 3 mol.L-1HCL 中（25ml 浓盐酸加水定容至 100ml 即为 3 mol.L-1HCL） ；4 0.02%（W/V）萘基乙烯胺溶液：0.020g 萘基乙烯胺溶于 100ml 去离子水中，贮于棕色瓶中；5 0.1mol.L-1KNO3 溶液：2.5275g KNO 3 溶于 250Ml 0.
9、1mol.L-1Ph7.5 的磷酸缓冲液中；6 0.025mol.L-1Ph 8.7 的磷酸缓冲液： 8.864 0g Na2HPO4.12H2O，0.0570g KH2OP4.3H2O，溶于 1 000ml 去离子水中；7 30%三氯乙酸溶液：30g 三氯乙酸。水溶后定容至 100ml。方法1. 标准曲线制作：管 号 1 2 3 4 5 6 7试剂（ml）亚硝酸钠标准液蒸馏水1%磺胺0.02%萘基乙烯胺每管含亚硝态氮（ug）0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.02.0 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0.04 4 4 4 4 4 44 4 4 4 4 4 40 0.2 0
10、.4 0.8 1.2 1.6 2.0摇匀后在 25 度下保温 30min，然后在 540nm 下比色测定。以亚硝态氮（ug）为横坐标（X） ，吸光值为纵坐标（Y）建立回归方程。2. 样品中硝酸还原酶活力测定1. 在取材的前一天加 50mmol/L KNO3或 NaNO3到培养苗的水中就可以诱导酶的产生。2. 称取作物叶片 0.5g（共 3 份，剪成 1cm 左右的小段（均匀） ，放入 3 只三角瓶中，其中 1 份作对照，另外 2 份作酶活性测定用。3. 反应：先向对照三角瓶中加入 1ml30%三氯乙酸溶液，然后各三角瓶中都加入 9ml 0.1mol/L KNO3溶液，混匀后立即放入干燥器中，抽
11、气 30 分钟（期间几次通入空气，再抽真空，使叶片完全沉入瓶底，后在 25黑暗中反应 0.5 小时，分别向测定瓶（对照瓶除外）加入 1ml30%三氯乙酸终止酶反应。4. 比色测定：将各瓶摇匀静置 2min 后，各取 2ml 反应液，加入 1ml 磺胺，摇匀后再加入41ml 萘基乙烯胺，再在 35水浴中显色 15min ，后比色，540nm5. 空白溶液：2ml 蒸馏水+1ml 磺胺+1ml-萘胺。同样和样液一样进行水浴 15min。三、结果计算单位鲜重样品中硝酸还原酶活性 g/ (g .h)tWxv12式中：为反应液酶催化产生的亚硝态氮总量，g ；V 1为提取酶时加入的缓冲液体积，ml；V 2
12、为酶反应时加人的粗酶液体积，ml；W 为样品鲜重，g；t 为反应时间，h。实验三 外渗电导法方法：1. 清洗用具：三角瓶一定要清洗干净。2. 取样与浸泡，最好用完整叶和根，以消除伤口的影响，用天平准确称取一定量的材料（如 0.1-1.0g）对应放入已编号的三角瓶中，加入一定量的去离子水浸泡，自然浸泡 2小时，可在震荡器上震荡，注意：各处理浸泡时间和测定温度要一致，一般应在室温条件下进行。3. 测定电导率：在测定前先将各管浸泡上下搅拌或摇匀再测定电导率，为了测定相对外渗电导值，需将测国电导率的材料，再放入沸水中煮沸 10-20 分钟，冷却至室温后再测一次总电导率值。4. 电解质外渗量的表示：直接
13、用电导率值表示电解质渗出率（%）=浸泡液电导率值/ 煮沸后电导率值*100温度校正：X 25=At1+0.02（t-25）X25 为校正成 25时的电导率， At 为在 t下实测电导率值。参考植物生理学实验技术张宪政 P 333， 辽宁科学技术出版社5实验四、植物中氮磷钾元素的测定一、代测液制备：1、 硫酸过氧化氢消煮法试剂配制：（1） 浓硫酸：分析纯（2） 30%过氧化氢测定步骤：称取 0.5000-1.000 克（通过 0.42mm 孔径）样品置 50ml 小开氏瓶中，用少量水湿润样本后，加入浓硫酸 5ml，摇动使硫酸与样本混合，放置半小时或过夜，在电炉上加热至瓶内硫酸开始回流（消化液呈酱
14、红色，冒大量白烟） ，微沸 5min，取下冷却，逐滴加入30%H2O2 约 0.5ml，再加热微沸 5min，取下稍冷却，添加 H2O2， 反复操作，直至消化液完全清亮为止(最高温度不要超过 350 度) 。添加 H2O2 量应每次逐渐减少。最后一次应微沸5min，以除尽剩余的 H2O2。冷却后先加入 10ml 蒸馏水，再无损地移如 100ml 容量瓶中定容，摇匀备用。 （注意：H 2O2 不能沾在开氏瓶上，以免影响磷的测定）二、 氮的测定用 2N KCl 提取：取新鲜土壤 10g，放入 100ml 三角瓶，加入 2N KCl50ml，用橡皮塞塞紧，振荡 30 分钟，立即过滤于 50ml 三角
15、瓶中（含量第可以 2.5：1）A 试剂：1） 复合液：28g NOH、5 gNa2EDTA.2H2O 和 50 g 酒石酸钾钠溶于 1L 去离子水中，保存于棕色瓶中。2） 催化液：150 g 水杨酸钠和 0.3 g 硝普钠溶于 1L 去离子水中，保存于棕色瓶中。3） 显色液：200 g NOH 和 250 g 苯酚定溶到 1L，保存于棕色瓶中。4） 混合液：催化液和显色液 1：1 混合，用前进行配制。5） 次氯酸溶液：60ml5.25%次氯酸钠溶液稀释到 1L，保存于棕色瓶中。6） 氮标准液：a：2.5mgNH 4+-N/ml 储备液：11.79g(NH 4)2SO4 定容到 1L。b：10ugNH 4+-N/ml 工作溶液：吸收 1ml 储备液，稀释到 250ml。B 步骤1） 打开分光光度计，预热 30 分钟。2） 吸收 1ml 样品液加入 10ml 容量瓶或刻度试管中。3） 吸收 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.7ml 工作溶液加入 10ml 容量瓶中，铵离子的浓度分别为 0，0.1，0.2
