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1、HLA-B 基 因 多 态 性 与 别 嘌 醇 皮 肤 不 良 反 应 的 相 关 研 究Study on the correlation between HLA-B gene polymorphism and allopurinoladverse skin reactions劳海燕 1 徐丹 2 杨敏 1 万波 1 郑志伟 1(1-广 东 省 医 学 科 学 院 广 东 省 人 民 医 院 药 学 部 广 州 市 510080;2-广 州 医 学 院 第 二 附 属 医 院 广州市 5 10260)Laohaiyan1 Xudan2,Yangmin1, Wanbo1, Zhengzhiwei
2、1(1-Guangdong academy of medical sciences affiliated hospital of Guangzhou medical university)Guangdong general hospital;2-The secondKeywords: HLA-B gene polymorphism,Allopurinol, adverse skin reactions摘 要 目 的 ： 研究 广东地区汉族人群 HLA-B 抗原基因多态性与别嘌醇致皮肤黏 膜损害不良反应的关联性，寻找别嘌醇致皮肤黏膜损害相关易感性生物标志。 方 法 ： 收 集符合由别嘌醇引起的皮
3、肤不良反应的患者血样标本 13 例 ，采用天根基因组 DNA 提取试剂盒提取基因组 DNA，NanoDrop 1000 检测总 DNA 浓度。采用 聚 合 酶 链 反 应 对 基 因 组 DNA 进 行 扩 增 ， 同 时 应 用 SeCore HLA 测 序 试 剂 盒 和 ABI3100 型 序 列 分 析 仪 行 毛 细 管 电 泳 进 行 测 序 反 应 ， 测 定 HLA-B 等 位 基 因 的 第 2 、 3 、 4 外显因子序列后， 使用软件将测序图谱与核酸序列数据库进行比对 ， 定 出 HLA 等 位基因型别，结合患者临床应用别嘌醇药物引起的不良反应，已完 成 对 13 例 由
4、别嘌醇引起的严重皮肤不良反应患者的 HLA-B 基 因多态性的分析。结 果 ： 13 例广东汉族别嘌醇过敏患者中有 11 例检测出 HLA-B*580101， 等位基因频 率 为 76.9%， 其 中 女 性 5 例 （ 100%） 全 部 检 测 出 该 位 点 ， 男 性 有 5 例 检 测 出 HLA-B*580101 ， 不 同 性 别 之 间 HLA-B*580101 等 位 基 因 频 率 无 统 计 学 差 异（X 2=2.438P=0.118） 。 结 论 : 我们的研究证明了别嘌醇致皮肤不良是与广东汉族 人携带的基因有密切相关的 , 特 别是 HLA-B*5801 等 位基因
5、是威胁生命的重要 的风险基因。同时，本研究为别嘌醇使用人群提供了临床检验的生物标志。基金项目：广东省科技计划项目(2007B031512007)劳海燕 主任药师、硕士生导师 研究方向：临床药理、临床药学研究别嘌醇是次黄嘌呤的同分异构体， 在体内可抑制黄嘌呤氧化酶而抑制体内尿酸合成， 是目前临床广泛使用的唯一一个抑制尿酸合成的抗痛风药， 广泛用于治 疗高尿酸血症相关的疾病，如痛风、Lech-Nyhan 综合征、多发性的肾结石 1。 别 嘌醇是国家的基本药物， 列入了国家基本医疗保险药品目录。 同时它也是一个有 临床应用前景的老药， 随着近年来药理学研究的进展， 发现别嘌醇还具有抗氧化 、 扩管等
6、药理作用， 已有研究者将其用于治疗心血管、 脑等多器官缺血再灌注损害 及慢性心衰。但临床应用出现严重的皮肤不良反应时有发生，甚至为致命性的 。 别 嘌 醇 SCAR 包 括 药 物 的 超 敏 症 （ HSS） 、 Stevens-Johnson 综 合 症 （ SJS） 、 毒 性 表皮坏死松懈症（TEN） 2、3 ，不良事件不可预测具有显著的发病率和死亡率。HLA 基因位于人第 6 号染色体短臂上， 是由一组紧密连锁的复等位基因位点 组 成。人类白细胞抗原（ HLA） 是最复杂的免疫遗传多态性抗原系统之一，参与 抗原递呈、 识别和免疫调节 。 不同种族 、 群体、 地域 HLA 等位基因的
7、分布存在差 异，不同人群中分布的差异与某些疾病的遗传易感性或抵抗性密切相关 4。随着临床的广泛使用， 别嘌醇引起的严重皮肤黏膜损害成为使用过程中的难 点。 我们拟采用 PCR-SBT 法直接对 HLA 基因座位的 DNA 序列进行分析， 得到高分 辨率的广东汉族人群 HLA-B 位点等位基因多态性数据， 找到易感性生物标志物以 区分易感人群是避免该类不良反应发生的有效途径。1 资 料与方法1. 1 研 究 对 象 辨别出符合别嘌醇引起的 SJS、 TEN、 HSS 诊断标准的 13 位患者 ，同意参加试验的患者， 签署知情同意书。 所有入选的患者由两名皮肤病学家通过复习照片、 病理切片、 病历
8、评估。 SJS/TEN 的诊断标准是根据 Roujeau 的临床形 态学定义 5。 我们定义 SJS 当10%体表面积， 重叠的 SJS/TEN10%体表面积 ， TEN 30%。 HSS 诊 断 标 准 ： 皮 疹 （ 例 如 全 身 弥 漫 性 斑 点 ， 剥 脱 性 皮 炎 ） ， 外 加 下 列 两条症状： 嗜曙红细胞增多 、 非典型的循环淋巴细胞 、 白细胞增多、 急性肝细胞 受损或肾功能衰竭 6。 所有入选的病历别嘌醇被认为是肇事药物。 如果服用别嘌 醇 首 3 月 SCAR 症 状发生且撤药后症状缓解。病人再次服用没有症状，有轻微皮 疹，不符合 HSS、SJS、TEN 诊断标准，
9、应被剔除。实验人群基本信息的采集： 包括患者籍贯、年龄、性别、家族病史、剂量、肝肾功能、不良反应发生时间、 临床表现、合并用药情况等与基本信息。1. 2 HLA-B 基 因测序分型：a 采集静脉血样 5ml，采用 5%EDTA 抗凝b 基 因 组 DNA制 备 采 用 天 根 生 物 科 技 有 限 公 司 的 血 液 基 因 组 DNA提 取 试 剂 盒 提取DNA，测定DNA浓度后将浓度调至20ng/uL,-70 0C保存。c HLA等 位 基 因 的 基 因 分 型 （ PCRSBT分 型 ） ： 采 用invitrogen 公 司 SeCore HLA测序试剂盒进行测序反应，测序产物使
10、用ABI3100型序列分析仪行毛细管电泳。1. 3 统 计学分析：采 用 SPSS13.0 软 件进行统计分析。基因频率采用直接计数法计算，组间基因频 率比较用四格表 X2 检验，以 P0.05 为有统计学意义。2 结 果2. 1 研 究 对 象 的 基 本 信 息 别 嘌醇过敏患者 13 例 ，均为广东汉族人，女 5 例 ，男 8 例 ， 发 病 年 龄 为 （ 58.5415.58） 岁 ， 多 数 为 中 老 年 患 者 。 发 病 前 1070天均因痛风而口服别嘌醇， 每天剂量为 0.10.6g， 皮疹表现为重症剥脱性皮炎 2例， 重症多形红斑型药疹 2 例， 红色粟粒样皮疹 4 例，
11、 麻疹样皮疹 3 例， 猩红热 样皮疹 2 例，。 13 例中 1 例青霉素过敏史，1 例油漆过敏史，3 例高血压病史 ， 3 例 糖 尿 病 史 ， 1 例 系 统 性 红 斑 狼 疮 ， 狼 疮 性 肾 炎 病 史 ， 1 例 药 物 过 敏 史 ， 其 余 否认食物、药物过敏史及肝炎病史。2. 2 临 床 表 现 13 例 患 者 发 生 时 潜 伏 期 各 不 一 样 ， 有 1 例 为 首 次 用 药 ， 另 12 例于 用药后的第 10180 发 生不良反应，临床表现可见各种斑疹、丘疹，头、面部 水肿， 口腔、 粘膜损害 ， 渗出， 糜烂， 眼结膜红肿， 发热， 血象异常， 有的并
12、发 肝、肾功能异常等。具体见附表 1。表 1 别嘌醇不良反应的临床表现临床表现 例次 构成比（%）皮肤-粘膜损害肾脏损害 发热11435018.213.6肝脏损害合并感染229.099.09合计 22 100注： 发热为体温在 37.439， 肝功能损害表现为药物性肝炎， 肾损害表现为尿少， 颜面浮肿 ， 血肌酐 360mol/L， 合并感染为药疹合并泌尿系统感染 1 例 ， 药疹合并肺炎 1 例。2. 3 HLA-B 基 因 多 态 性 分 布 对 13 例广东汉族患者 HLA-B 基因进行分型，共检测出 HLA-B 等 位 基 因 12 种 ， HLA-B 基 因 多 态 性 以 及 基
13、因 分 布 频 率 分 别 如 表 2、 3 所示。表 2 广东汉族人群 13 例别嘌醇过敏患者 HLA-B 基因多态性病例号 性别 年龄 HLA-B 基因分型01020304050607080910111213女男 女 男 男 女 女 男 男 男 女 男 男79597542496759326675347054B*39010101B*1301 B*1502 B*350201 B*1519 B*3901010 1B*5401 B*5401 B*460101 B*4001 B*4001 B*4001 B*3501B*580101B*580101 B*580101 B*5401 B*580101B*
14、580101B*580101 B*580101 B*580101 B*580101 B*580101 B*5604 B*3802表 3 广东汉族人群别嘌醇过敏患者 HLA-B 基因频率分布HLA-B 等位基因 基因数目 等位基因频率（%）B*580101B*39010101 B*1301 B*1502 B*35020110211176.915.47.697.697.69B*1519B*5401 B*460101 B*4001 B*3501 B*3802 B*560413131117.6923.17.6923.17.697.697.6913 例广东汉族别嘌醇过敏患者中有 11 例检测出 HLA-
15、B*580101， 等位基因频率 为 76.9%， 其 中 女 性 5 例 （ 100%） 全 部 检 测 出 该 位 点 ， 男 性 有 5 例 检 测 出 HLA-B*580101 ， 不 同 性 别 之 间 HLA-B*580101 等 位 基 因 频 率 无 统 计 学 差 异（X 2=2.438P=0.118） 。 携带该基因多态性位点的患者年龄平均为 59.5 岁。 另外 ，HLA-B*5401 和 HLA-B*4001 位点的等位基因频率为 23.1%。3 讨 论随着对 HLA 基因研究的进展， 其特殊的等位基因与药物皮肤严重不良反应的 相关性已有报道，如 HLA-A29、B12
16、、DR7 与磺胺引起的 SJS 相关，HLA-A2、B12 与 非 甾 体 抗 炎 药 引 起 的 SJS 相 关 6， HLA-B59 与 SJS 的 眼 损 伤 相 关 5。 近 期 报 道 了 HLA-B*1502 与 卡 马 西 平 引 起 的 SJS 强 相 关 7， 抗 艾 滋 病 药 物 abcavir 的 超 敏 反 应 与 HLA-B*5701 及 MHC 区 域 的 haplotypic Hsp70-Hom variant 相 关 7、 8。 上 述研究提示 MHC 区域的 HLA-B 等位基因或其它基因的多态性在药物引起的免疫介导的皮肤损伤中起到了重要的作用。 特异性的 HLA-B 分子可能对特定的药物或其 代谢产物起到抗原提呈的作用， 而激活 T 细胞。 上述研究成果为我们提供了一个 思路， 别嘌醇诱发的皮肤黏膜损伤是否也与 HLA 基因的多态性相关联。 台湾地区 Shuen-Iu Hung 等 报 道
