《VSV病毒扩增与标定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《VSV病毒扩增与标定（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、50组织细胞感染量(TCID50)试验 指能使半数单层细胞管(孔) 出现细胞病变的病毒稀释度。此法估计病毒感染性的强弱和含量，不能准确测定感染性病毒颗粒的多少。1待测病毒液按 10 倍系列稀释法稀释2各稀释度的病毒接种于形成单层的细胞瓶或培养板（每稀释度接种几 瓶） 。3将细胞瓶或培养板置于温箱 37培养数日。4观察 CPE, 找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按 Reed Muench 法计算出该病毒液的 TCID50 效价。例如使 50%细胞管出现病变的病毒稀释度在 10-410-5 之间，其中间距离比例按下式计算：中间距离高于 50的病变率（按瓶计）50/ 高于 50的病变率低
2、于 50的病变率。假定中间距离为 0.5。故能使 50%细胞管发生病变的病毒稀释度为 10-4.5，即 TCID50 为 104.5 倍，当病毒悬液做 104.5 倍稀释时，0.1ml 中含 1 个 TCID50。50-100T CID50 的 VSV 就是发生的病变时的的 VSV 稀释浓度的倍数。2.1 材料与仪器2.1.1 实验材料Eagles 最低限度培养基（MEM）：MEM 粉末（Gibco 公司产品，1L 装）溶于 1L 双蒸水， 0.22m 微孔膜过滤除菌，分装，37无菌检验一周后，置于 4保存。使用前加入经 56水浴灭活 30min 的新生小牛血清（四季青生物工程材料有限公司产品
3、） ，双抗（青霉素和链霉素各 250 单位/mL） ，用 NaHCO3 调 pH 至 7.27.4。1%维尔烯（Versene）：EDTA 10.0g，NaCl 8.0g，KCl 0.2g ，Na2HPO4 1.15g，NaH2PO4 0.2g，葡萄糖 0.2g，加去离子水至 1000mL，pH7.4。细胞消化液：1%胰酶（Difco）5mL，1%维尔烯（Versene）2mL，用不含钙和镁的 PBS（pH=7.2）定容至 100mL。Difco 和 Versene 的最终浓度分别为 0.05%和 0.02%，用无菌膜过滤除菌后备用。结晶紫染液：结晶紫 0.5%（ w/v） ，NaCl 0.8
4、5% （w/v） ，乙醇 50%（v/v） ，甲醛 3%（v/v） ，蒸馏水 47%（v/v） 。脱色液：乙二醇甲醚（Ethylene Glycol Monomethyl Ether）50%，蒸馏水 50%。2.1.2 实验仪器酶标仪 MR550 型：美国 Bio-Rad 公司产品；倒置显微镜 IMT-2 型：日本 Olympus 公司产品。2.1.3 测定细胞与攻击病毒人羊膜细胞（WISH）株和水泡性口炎病毒（ VSV）株：由上海第二军医大学惠赠。2.1.4 标准品干扰素 标准品（Lot 03/94，效价 12,000 IU/mL）100 倍稀释分装：由上海第二军医大学惠赠2.2 实验方法2
5、.2.1 Wish 细胞的培养取出保存于-80的 Wish 细胞株， 37水浴解冻后，1000r/min 离心 5min，弃上清；沉淀用含 10%小牛血清的 MEM 培养液悬浮，移至细胞培养瓶，加入适量培养液置于含 5CO2 的 37培养箱内，出现均匀的单层细胞，每 23 天传代一次，实验时取对数生长期细胞。2.2.2 VSV 的扩增与保存 80用含 10%小牛血清的 MEM 培养液按 1:200 稀释 VSV，接种于生长良好的单层 Wish 细胞中进行增殖，孵育至细胞病变达 75%100%时，即可冻存于-20 以下。次日取出，反复冻融 23 次，再用巴氏管吹打，3000r/min 离心 20
6、min，收集上清。根据每次用量分装，冻存于-80以下，毒种应冻存于液氮中。VSV 容易在生长繁殖中产生各种变异株，其中最重要的是一种所谓“缺陷型干扰颗粒” （Defective Interfering Particles，DI）变异株。DI 颗粒是一种比正常VSV 病毒小得多的不完全的病毒体，所含 RNA 较小，缺少转录酶活性，所以DI 颗粒感染细胞后单独不能增殖，必须与野生株一起才能增殖。 。但是，DI 颗粒与野生株一起增殖时，又会“竞争性”地抑制后者，并因此出现“自身干扰现象” 。另外，这种DI 颗粒还可导致“超敏感细胞” ，形成“持续感染状态” ，这种处于持续感染状态的细胞对野生病毒攻击
7、有抵抗力。当用 VSV 的野生株以高“感染复数” （MOI，即低浓度稀释）进行连续传代时，即可产生大量的 DI 颗粒，并因而使病毒滴度急骤下降。 。防止 DI 颗粒形成的措施是：首先应以低“感染复数”传代，其次应尽可能减少传代次数。因此，为防止产生 DI 颗粒，每次扩增的量至少应够用 6 个月以上2.2.3 VSV 效价的滴定 81每次 VSV 扩增之后，应进行 VSV 效价滴定，以确定本批次病毒的活性并计算 TCID50。将生长良好的单层 Wish 细胞用细胞消化液将其消化下来，再用含 10灭活新生小牛血清的 MEM 培养液配成细胞浓度约 3104 个/mL 的悬液，96 孔细胞培养板上每孔
8、加入细胞悬液 100L（约 300-500 个细胞/孔） ，置 37孵育至生成均匀的细胞单层。用含 5灭活新生小牛血清的 MEM 培养液将病毒作连续 10 倍稀释（如 10-1-10-10） ，每个稀释度作 6 个重复。弃去培养板中上清，每孔加入病毒稀释液 100L。细胞对照孔加入100L 含 5灭活新生小牛血清的 MEM 培养液。置 37孵育，以 24h 时微量板孔中半数出现细胞病变现象的稀释度为 1 个 TCID50，此稀释度的倒数乘以 10 倍作为病毒效价（TCID50/mL）在 VSV 使用前应先按照病毒效价进行稀释，用于攻击的病毒每孔效价应该维持在 100-300 个 TCID50/
9、mL。2.2.4 微量 CPE 测定法82按中国生物制品规程 （一部）中要求采用 Wish 细胞VSV 体系测定，根据干扰素对 Wish 细胞的保护性，即细胞的病变程度按 5 级打分法记录不同浓度时的保护性用国家标准品(Lot 03/94)为参考标定其 IU 值。2.2.5 结晶紫染色测定法83结晶紫染色测定法基于结晶紫染液可通过细胞的特定摄生法而选择性地被细胞核吸收，死亡的细胞几乎不吸收，这样结晶紫染料的吸收量与活细胞数成正比，而被核（DNA）吸收的结晶紫又可为有机溶媒提取，所以可根据提取液颜色深浅来判断活细胞的多少，即通过测定提取液的光密度值（OD）来确定活细胞的数量 4。将生长良好的单层
10、 Wish 细胞用含 10小牛血清的 MEM 培养液配成细胞浓度约 5105 个/mL 的悬液，加到 96 孔细胞培养板上，75L/孔。培养 24h 后，每孔加入 4 或 5 倍梯次稀释的干扰素样品 75L，样品稀释用含 8小牛血清的MEM 培养液，每个样品 4-6 个平行孔，阴性（即细胞对照）和阳性（即病毒对照）对照孔均不加干扰素，每孔加入 75L 含 8小牛血清 MEM 培养基。培养2024h 后，弃上清，用含 4小牛血清 MEM 培养基稀释的 VSV 病毒攻击，100L(200TCID50)/孔，阴性对照孔加入 100L/孔含 4小牛血清 MEM 培养基。然后于含 5CO2 的 37孵箱
11、中培养至所有阳性对照孔病变达到 3 级以上，弃上清，每孔加入 40L 结晶紫染液，室温染色 20min，弃掉染液，用自来水冲残余的染液，吸干后，每孔加入 100L 的脱色液脱色，测定每孔 A550 值。2.2.6 干扰素效价的计算方法81本实验引进病毒滴度测定的 Reed-Muench 法计算干扰素效价（U/mL） ，再以干扰素标准品为参考，校正待测品的效价（IU/mL） 。国际上最常采用的判定干扰素活性的方法是在标本的梯次稀释度中，仍能保护半数细胞免受攻击病毒损害的最高稀释度的倒数即为干扰素的效价。该方法的步骤为： 根据 ELISA 测定 550nm 吸收值进行计算OD保护OD实测OD病毒对照OD破坏OD细胞对照OD 实测； 累积和计算保护百分比； 用插入公式计算 IFN 效价 按平行操作和同法计算的标准 IFN 活性效价的标定值进行工作单位修正
