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1、猪瘟流行新特点与疫苗免疫宁宜宝中国兽医药品监察所猪瘟是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的猪的一种危害严重的烈性传染病，其特征为小血管的变性导致组织器官多发性出血、坏死和梗死。近年来，猪瘟的流行特点发生了很大的变化，多以非典型性、慢性及隐性形式出现，特别是不表现临床症状带毒母猪的垂直传播及猪群中水平传播是造成目前猪瘟持续感染的根本原因。猪瘟病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus） 。病毒为球形，有囊膜，大小为 4060nm，二十面体的核衣壳被 3种结构蛋白形成的液态膜所包裹。病毒基因组为单股正链 RNA，长约
2、12.5kb。在过去的十年约有二十余株猪瘟病毒全序完成了测定。病毒基因组包括一个大的开放读码框，编码4种结构蛋白（C（p14）,E rns(gp48),E1(gp33),E2(gp53)）和 7种非结构蛋白（P7,NS2,NS3,NS4AB,NS5AB） 。猪瘟病毒的感染性克隆目前已成功制备，其可用于病毒的复制、致弱以及致病机制等的研究。猪感染猪瘟病毒能产生一系列临床症状，感染的过程多种多样：急性、亚急性、亚临床、慢性以及迟发性。潜伏期为 214d，这个时期的猪开始排毒。仔猪的死亡率比成年猪高，架子猪的病毒血症持续期比仔猪短。自然条件下口鼻接种是最易感的途径。扁桃体是猪瘟病毒感染后最初的复制场
3、所。感染康复后的猪产生的抗体能持续终身，康复猪血清中和抗体出现在感染后 1428d。自然感染猪血清抗体主要是针对结构蛋白 E2、E rns以及非结构蛋白 p80。针对E2囊膜蛋白的抗体在体外能中和猪瘟病毒。而猪利用 Erns蛋白进行免疫则不能产生可检测的中和性抗体，但是针对强毒猪瘟病毒攻击却能提供部分保护。猪瘟仍然是目前危害我国养猪业的最为重要的疾病一、猪瘟免疫失败的原因1母猪持续感染与垂直传播母猪持续感染和仔猪胎盘感染是目前引起免疫失败的重要原因。我们首次在实验室成功地利用猪瘟野毒人工复制了猪瘟病毒持续感染的带毒母猪动物模型，此母猪可带毒 750天。这种猪甚至可以终生带毒、排毒，可成为猪瘟病
4、毒的主要储存宿主，血液中的含毒量可达 105106PFU/ml。最早报道猪瘟胎盘感染是在 1955年，以后此类报道逐渐增多。胎盘感染后，引起母猪繁殖障碍，出现弱胎、死胎、甚至木乃伊胎，从死亡仔猪体内可分离到猪瘟病毒。为了研究持续感染母猪对仔猪的胎盘垂直传播情况，再将这头母猪与人工感染另一株猪瘟野毒的带毒公猪或健康公猪自然交配或人工受精使其怀孕产仔，可产下带毒的木乃伊胎和死胎，用猪瘟荧光抗体检查胎猪均为阳性，此后该母猪不能再次配种。为了解带毒母猪对同居猪和环境的污染情况，在母猪带毒 273天时，用健康阴性猪与之同居，可造成同居猪感染。至此成功地人工复制了猪瘟病毒胎盘垂直传播及水平传播的动物模型，
5、在实际工作中，这些持续感染带毒猪的存在，可形成猪瘟常发地区和猪瘟常发猪场。由这种母猪产下的仔猪多为先天免疫耐受猪，这种情况常常导致猪瘟在猪场形成恶性循环，即猪瘟亚临床感染胎盘感染母猪繁殖障碍仔猪带毒后备母猪亚临床感染。如此恶性循环，使得带毒猪在临床中有 3-33%的带毒率。2仔猪先天免疫耐受由母猪持续感染和仔猪胎盘感染引起的免疫失败现象，除了出现上述生产水平降低的情况外，经胎盘感染出生后存活的仔猪往往成为持续感染者，可长期带毒、排毒，其本身并不表现临床症状。这种猪除了对猪场造成恶性循环外，这种经胎盘感染的仔猪出生后，吸允初乳，数日内病毒血症可一过性降低，但病毒存在于全身上皮组织、淋巴样组织和网
6、状内皮组织，这种感染猪不能建立中和性抗体应答，形成免疫耐受，以至于对疫苗免疫后不能产生免疫应答。Liess用低毒力的野毒 Glentorf株给妊娠 40、70、90 日龄的母猪滴鼻感染，结果引起母猪繁殖障碍，仔猪出生后多为死胎、木乃伊胎、流产，或出生后在1周内到 11周内死亡，出生后存活的发病猪无临床症状，解剖为胸腺萎缩、淋巴结肿大。由此证明了持续感染带毒母猪所产仔猪对疫苗免疫后不能产生保护作用的免疫耐受机制。另外，我们模拟生产中的实际情况，对无临床症状的猪瘟阳性经产母猪所产仔猪进行免疫效力试验研究。两头母猪分别产下两窝仔猪，带毒率分别为5/11和 12/14，产仔时按仔猪产出顺序隔头进行临时
7、猪瘟兔化弱毒疫苗接种，1小时后再吸初乳，再用标准石门强毒进行攻击。免疫猪瘟疫苗不能使带毒仔猪产生免疫保护力，接种疫苗的 5头猪在强毒攻击后死亡 4头。结果：猪瘟病毒持续感染对胎儿发育有不同程度的影响；猪瘟病毒持续感染母猪可经过胎盘垂直传播病毒给仔猪，攻击前死亡的猪全是带毒猪；吃初乳和疫苗接种不能阻止带毒仔猪的死亡，并且形成免疫偏离现象或免疫耐受现象，导致免疫失败，甚至诱发猪瘟，通过此项试验也得到了证实。通过病理切片观察，猪瘟病毒持续感染可导致母猪生殖器官产生病理变化，特别是卵巢的病理变化，使卵泡结节化，降低或失去排卵功能，最后导致功能障碍及繁殖障碍。3带毒公猪的垂直传播用 RT-PCR检查带毒
8、公猪自然交配所产死胎的病毒基因型，结果表明：死胎感染的病毒基因型与带毒母猪原有的病毒基因型不同，而与带毒公猪的病毒基因型相同。试验证明带毒种猪不仅能通过母猪胎盘垂直传播，而且能通过公猪精液垂直传播猪瘟，这是造成猪瘟持续感染的又一重要原因。综上所述，猪瘟持续感染母猪造成的垂直传播是引起仔猪死胎、木乃伊胎、弱胎及不发病的仔猪带毒的主要原因之一，加之它所产生的水平传播方式，还会造成其它猪的感染并污染环境。因此一旦种猪场有猪瘟病毒持续感染的种猪存在，就会引起免疫耐受，导致免疫失败，时刻都有猪瘟发生的危险。因此要根除猪瘟就必须从源头抓起，及时淘汰带毒种猪，对种猪场进行彻底净化。4非猪瘟病毒感染对猪瘟疫苗
9、免疫效果的影响 造成猪瘟持续感染的原因目前还不十分清楚，经初步研究还证实：猪瘟病毒反复多次感染及 PPV、PRV 和 PRRSV混合感染均可造成猪瘟病毒在体内的滞留而造成持续感染。利用 20头 9月龄左右猪瘟、伪狂犬、猪繁殖与呼吸障碍综合症抗原、抗体阴性猪，将其分成 6组，分别利用猪细小病毒（PPV） 、猪伪狂犬病毒（PRV）和猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒（PRRSV）单独或混合感染，7 天后，连同对照猪 4头，免疫接种猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV） ，13 天后连同 4头阴性对照猪一起攻击猪瘟石门强毒。整个试验期间分别每天测温，观察临床症状，每周采集扁桃体和血样做各种病毒抗原及抗体检测。结果在攻
10、击石门强毒后 2周，单独和混合感染了非猪瘟病毒后接种 HCLV疫苗的 4个免疫组 12头猪除 1头外，11 头全为 HCV抗原检测阳性，且多呈强阳性；而单一 HCLV疫苗免疫组在猪瘟强毒攻击后检测不到 HCV；所有 HCLV疫苗免疫猪均存活，而非免疫对照组 4头猪全部在攻毒 16日内死亡。试验表明非猪瘟病毒感染的确对猪瘟疫苗免疫效果有影响，能造成猪瘟疫苗免疫的失败。5母源抗体及疫苗免疫程序对疫苗免疫的影响经试验表明，当母源抗体水平在 116 时，使用 2 个免疫剂量疫苗接种 3头猪，在强毒攻击后，虽然这些猪均存活下来了，但 3 头猪均有持续 24-72 小时的潜伏期，体温升高 1.5-2，持续
11、 2.5-8 天，而使用 4 个剂量免疫接种的3 头猪，仅 1 头体温升高 2，持续时间仅为 2.5 天。其他两头猪既无潜伏期，又无体温升高。试验表明，提高疫苗中的病毒含量对母源抗体不整齐的猪场的猪瘟控制是非常必要的。目前欧洲为了消灭猪瘟的亚临床感染，多采用加大免疫剂量的方法。欧洲药典规定用 C株疫苗免疫时，肌肉注射剂量为100PD50（400RID） 。我国猪瘟细胞苗出厂检验以 5万倍稀释能致兔体热反应为合格，即每 ML 原液含 5万个 RID，规定的免疫剂量为 150 RID（含 37PD50） ，远远低于国际标准，况且我国猪场中存在的猪瘟持续感染问题和其他病原混合感染的问题比发达国家严重
12、的多，使用常规免疫剂量预防接种，在母源抗体参差不齐和有猪瘟病毒持续感染的猪场，要想有效地控制猪瘟是不可能的，很有必要借鉴发达国家控制猪瘟的做法，提高疫苗的质量标准。我国政府采购制定的标准符合这一要求。6疫苗质量对免疫效果的影响猪瘟疫苗的质量好坏，直接影响猪瘟的免疫效果。我国的猪瘟疫苗存在两大问题，一是疫苗中病毒含量低。在脾淋组织疫苗方面，我国现有猪瘟兔脾淋组织疫苗工艺落后，制造疫苗所需的大耳白兔子数量太少，而且由于品种退化的原因，远远满足不了需要，同时效力检验的标准太低；在牛睾丸原代细胞疫苗方面存在的问题更大，我们现有的标准只有欧洲等发达国家的 1/4，病毒含量太低，在其他疾病混合感染，母源抗
13、体存在的情况下，很难达到应有的免疫效果。除此之外，由于牛感染 BVDV非常普遍，有牛睾丸原代细胞生成疫苗，不可避免的会遭到 BVDV污染，污染了这种病毒，一是直接影响病毒在细胞中的增殖，同时还会造成 BVDV疾病的传播，直接影响胎儿存活。运输的冷链系统不完善导致猪瘟病毒存活力降低也是引起猪瘟免疫失败的重要原因。我国的中国系（C 系）猪瘟兔化弱毒疫苗是目前世界上最好的猪瘟疫苗，世界上许多国家通过免疫接种这种疫苗，控制以至消灭了猪瘟。我们的实验室工作也证明，猪瘟兔化弱毒疫苗免疫接种猪可有效地抵抗多种野毒株的攻击。因此可以认为，猪瘟兔化弱毒疫苗仍然是目前我国使用控制猪瘟最为有效的疫苗。尽管猪瘟兔化弱
14、毒疫苗有如此之多的优点，但在实际应用中，疫苗的质量问题仍是大家非常关心问题。我国猪瘟的免疫失败跟猪瘟疫苗的质量有着直接的关系。我国猪瘟疫苗存在的问题主要有以下几个方面：（1） 细胞疫苗：1） 利用牛睾丸原代细胞制造的疫苗疫苗生产工艺不稳定，批间差异大，病毒滴度太低，免疫效果差；2） 利用牛睾丸细胞生产疫苗容易导致 BVDV或 BDV的污染。BVDV 和 BDV与 HCV同属瘟病毒，均可导致胚胎发育不良或死亡和形成免疫耐受。用污染BVDV或 BDV的细胞生产疫苗，由于竞争抑制的原因，猪瘟病毒在细胞中的增殖会明显受到影响，这也是导致猪瘟牛睾丸原代细胞疫苗毒价低的主要原因之一。（2）脾淋组织疫苗：1
15、）制造疫苗所需的大耳白兔子数量太少，而且由于品种退化的原因，远远满足不了需要。2) 生产工艺落后，利用动物组织制苗，易造成外源病原污染，由于当前我国缺乏制苗兔子的质量标准，特别是对兔子体内的病原缺乏检测方法和标准，很难保证疫苗的纯净性。如兔出血热病毒。试验证明：用兔出血热病毒疫苗免疫兔，影响 HCV的增值。新近研究成功的用传代细胞系生产的猪瘟疫苗则很好的解决了这一问题。该疫苗的病毒含量比原代细胞生产的疫苗提高了近 20倍，达到甚至超过了政府采购的疫苗标准。同时有效解决了疫苗中 BVDV或 BDV外源病原污染的问题。二、猪瘟疫苗的研究进展1.传统疫苗的研究猪瘟疫苗的发展经历了早期的灭活苗、弱毒苗
16、到现在的基因工程疫苗。灭活苗因其免疫效果较差，只在 5060 年代使用过。目前广泛使用的是弱毒疫苗。我国批准使用的弱毒疫苗是由中国兽医药品监察所研制的猪瘟兔化弱毒疫苗。猪瘟兔化弱毒疫苗是目前世界上应用最为广泛的疫苗。其包括组织苗（淋脾苗）和细胞苗，二者均用于预防猪瘟。我国 1954年成功培育出猪瘟兔化弱毒株并制成疫苗（CLS） ，也叫“C 株”或“K 株” 。疫苗病毒的复制主要在淋巴样组织，特别是扁桃体，但有时能从肾脏检查出苗毒抗原。该苗毒株不通过怀孕猪的胎盘屏障感染胎儿。猪瘟兔化弱毒株毒力不返强，在猪体内连续传代后仍保持原弱毒的特性。对乳猪和种猪无残余毒性。接种各年龄的各品种猪，不产生猪瘟临床症状，仅出现轻微病毒血症，免疫后 432d 内，免疫猪不从尿中排毒，免疫猪与非免疫猪同圈饲养60d，不发生接触感染。检查免疫猪脏器带毒情况，证明免疫后 7d的猪体中脾及血尚存微量毒，17d 以后，免疫猪的血液、脾及骨髓中已均无病毒存在。免疫 1014 日龄哺乳仔猪，不影响发育，注射怀孕 13 月母
