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1、浙江工业大学生物与环境工程学院生物化学实验论文姓 名： 组 员： 学 号： 学 科： 食品科学与工程所在院系：生物与环境工程学院指导教师： 邱乐泉 2012 年 12 月 1 日填啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了解酶的初步提取及纯化方法，并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法；用 Folin-酚试剂、微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法，SDS-PAGE 测定蛋白质的相对分子质量。除此之外，还要掌握高速离心机、Q-Sepharose 柱层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。这一系列实验需要实验预制作酵母的自溶，大约 3 天以后，酵母细胞壁破裂，胞液流出
2、，经多次分别离心得到初提液 A、热提液 B 和乙醇提取液 C。利用 Q-Sepharose 柱层析法洗脱乙醇提取液 C 得到洗脱液 D 并在 280nm 处测 D 的吸光值，用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试，发现洗穿透峰得到的第 1、2管酶活力高，从第 3 管以后吸光值开始下降，且吸光值大的酶活力较大。得到4 种酶提取液样品以后，便可以制作葡萄糖标准曲线，进行定量酶活力测定，葡萄糖标准曲线是一条直线，根据曲线回归方程计算 4 个样品的总活力单位数和酶回收率，比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。随后用 Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏
3、定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并且知道随着酶的提纯，A、B、C 、D4 个样品的纯化系数升高，比活力升高，总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降，其中 A 的蛋白质含量最高，D 的纯化程度最高。最后用 SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、考马斯亮蓝的染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量，得到 2 条蔗糖酶条带，计算的蔗糖酶相对分子质量。关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮法；SDS-聚丙烯胺凝胶Summary：To understand the the enzymes prelimin
4、ary extraction and purification methods, and on this basis to master the principles and methods of determination of enzyme activity; Folin-phenol reagent, trace Kay ceremony will be the principles and methods of nitrogen determination of the protein content, SDS-PAGE protein determination of therela
5、tive molecular mass. In addition, we must master the use of high-speed centrifuges, Q-Sepharose column chromatography, UV spectrophotometer, Kjeldahl instrument, distillation apparatus, electrophoresis.This series of experiments requires experimental pre-production - yeast autolysis, about three day
6、s later, the yeast cell wall rupture, cytosolic outflow to the beginning of extracts A, after repeatedly respectively centrifugal heat extracts B and ethanol extract C. Using Q-Sepharose column chromatography to obtain an eluate D eluted ethanol extract C and the absorbance value of the 280nm measur
7、ed at D, the enzyme activity test, and found to penetrate wash peak obtained with glucose tests strips qualitative 1,2 tube enzyme activity began to decrease from the absorbance values after 3 and suck the light value greater enzyme activity. Later to obtain four kinds of enzyme extraction fluid sam
8、ple, it can produce a standard curve of glucose, quantitative enzyme activity assay, the glucose standard curve is a straight line, according to the regression equation to calculate the number of units and enzyme recovery of the total activity of the four samples, and comparing the calculated result
9、s You can know are reduced as the number of units of the total activity of the purified enzyme sucrase continues and enzyme recoveries. Followed by the protein content in the measured samples of the Folin-phenol reagent method, micro Kjeldahl nitrogen method results were compared, which measured the
10、 total protein content than the former, and know with the purification of the enzyme, A, B, C, D4 samples purified coefficient increases, increased specific activity, the total enzyme activity, total protein and protein recovery is on the decline, wherein A is the highest protein content, D, the hig
11、hest degree of purification. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel sample screening separation test brilliant blue staining, elution step measurement of protein molecules and dye migration distance Indirect determination of the relative molecular mass of sucrase get two the sucrase strip sucras
12、e relative molecular mass, the calculatedKeywords: sucrase; extraction and purification; enzyme activity assay; Folin-phenol reagent; micro-Kjeldahl method; SDS-polyacrylamide gel正文：1、文献综述1.1蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于 21,2 糖苷键, 将蔗糖水解为 D2 葡萄糖和 D2 果糖1 。随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他
13、研究，越来越需要纯度高的酶制剂。由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据你所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理化学及生物学性质来确定分离提纯方法。各种酶的纯化通常有五个阶段：材料的选择与预处理；细胞破碎；抽提；纯化；浓缩干燥及保存。2、实验原理、材料和方法2.1 蔗糖酶的提取及初步提纯2.1.1 实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取
14、、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。2.1.2 试剂与器材2.1.2.1 试剂新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来） ；醋酸钠（AR） ；甲苯（AR） ；4mol/L 醋酸；95%乙醇（ -20） ；0.5mol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。称取 121.1g Tris 溶于 1500ml 的蒸馏水中，用 4 mol/L HCl 调节 pH 至 7.3（HCl 量约为 230ml） ，用蒸馏水稀释到 2L，即为 0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液。0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液：将 0.5mol/L Tris-H
15、Cl pH7.3 缓冲液稀释 10 倍即得。注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。2.1.2.2 器材锥形瓶 250ml（1） ，50ml（1） ；量筒 10ml（1）25ml（1）;烧杯 100 ml（1 ） ，1000 ml（1） ；具塞试管 10 ml（3） ；吸球、玻棒、滴管、pH 试纸；培养箱；恒温水浴箱；磁力搅拌器，搅拌子；高速冷冻离心机。2.1.3 操作方法1 酵母的自溶 ：培养 60 小时2 初提取液 A在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，经操作取上层液体记体积为 VA=14.8ml。3 热提取液 B： VB=13.0ml。4 乙醇沉淀提取液 C将热提取液 B 倒入 10
16、0ml 小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加 98%的冰乙醇， 30min 后继续搅拌 5min，离心，平衡（用 50%的乙醇，对方加） ，用 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3 缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得 Vc=5.0ml。2.1.4 结果与分析2.1.4.1 结果表 2-1提取液 颜色状态 体积（ml） 分析评价A 棕黄色液体 25.62 过大B 橙黄色液体 24.00C 淡黄色液体 6.10 过小 VA 总 =VA=25.62mlVB 总 =VBVA/(VA-3)=24.0mlVC 总 =VcVA/(VA-3) VB/(VB-3)=VcVB 总 /(VB-3)=6.1ml2.1.4.2 分析在这次试验中，数据为初始数据，实验结果的真实可靠是以后实验的保障。我们的数据在 A
