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1、 ELISA 系列讲座四ELISA 原理与分类1.ELISA 的原理ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原 或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用 洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上 。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物 质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性
2、或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很 高的敏感度。2.ELISA 的类型ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在 这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即免疫吸附剂 （immunosorbent）；（2）酶标记 的抗原或抗体，称为结合物（conjugate ）；（3）酶反应的底物。根 据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的 ELISA 主要有以下几种类型： 2.2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固
3、相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗 涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受 检抗原的量相关。4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大 分子抗原，例如 HBsAg、HBeAg、AFP、hCG 等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合 物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不
4、同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原 上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一 起保温反应，作一步检测。在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成 夹心复合物。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带 上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈 钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显
5、色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂 测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中 HBsAg、AFP 和尿液 hCG 等）时， 应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克 隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如 HBsAg 的 a 决定簇，也可用 针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在 HBsAg 的检测中应注意亚型 问题， HBs Ag 有 adr、adw、ayr、ayw4 个亚型，虽然每种亚型均有相同的 a 决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（ RF）的干扰。RF 是
6、一种自身抗体，多 为 IgM 型，能和多种动物 IgG 的 Fc 段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有 R F，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用 F（ab）或 Fab 片段作酶结合物的试剂，由于 去除了 Fc 段，从而消除 RF 的干扰。双抗体夹心法 ELISA 试剂是否受 RF 的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。2.2.2 双抗原夹心法测抗体反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以 检测相应的抗体。与
7、间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代 替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗 HBs 的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2.2.3 间接法测抗体间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法 （见图 2-3）。操作步骤如下：1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特
8、异性 抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人 Ig 以检测总 抗体，但一般多用酶标抗人 IgG 检测 IgG 抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体 抗体结合，从而 间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4）加底物显色本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的 方法。间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特 别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以 E.Coli
9、 为工程 酶的重组抗原，如其中含有 E.Coli 成份，很可能与受过 E.Coli 感染者血 甭中的抗 E.Coli 抗体发生 反 应。抗原中也不能含有与酶标抗人 Ig 反应的物质，例如来自人血浆或人体 组织的抗原，如不将其中的 Ig 去除，试验中也发生假阳性 反应 。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性 IgG 只占总 IgG 中的一小部分。IgG 的吸附性很强，非特异 IgG 可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因 此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白
10、）再包被一次，以封闭（blocking ）固相上的空余间隙。另外， 在检测过程中标本须先行稀释（1:401:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。 2.2.4 竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗 体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直 接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固 相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进
11、行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗 原竞争结合，抗 HBc ELISA 一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相 上的抗原反应。抗 HBe 的检测一般采用此法。2.2.5 竞争法测抗原小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的 抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素 、药 物等 ELISA 测定多用此法。2.2.6 捕获包被法测抗体IgM
12、抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法 ELISA 一般仅适用于检测总抗体或 IgG 抗体。如用抗原包被的间接法直接测定 IgM 抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的 IgG 抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份 IgM 抗体不能结合到固相上。因此如 用抗人 IgM 作为二抗，间接测定 IgM 抗体，必须先将标本用 A 蛋白或抗 IgG 抗体处理，以除去 IgG 的干扰。在临床检验 中测定抗 体 IgM 时多采用捕获包被法。先用抗人 IgM 抗体包被固相，以捕 获血清标本中的 IgM（其中包括针对抗原的特异性 IgM 抗体和非 特异性的 IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性 IgM 相
13、结 合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标 本中的 IgM 成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式见图 2-7。 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定 IgM 抗体，导致假阳性反应。因此中和 IgG 的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM 和抗弓形虫 IgM 抗体已获成功。2.2.7 ABS-ELISA 法ABS 为亲和素(avidin)生物素(biotin) 系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量 60000，每个分子由 4 个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量 244。
14、用化学方法制成的衍生物素- 羟 基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特 异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与 4 个生物素分子结合，因此如把 ABS与 ELISA 法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种 类型。两者均以生物素 标记的抗体（或抗原）代替原 ELISA 系统中的酶标抗体（抗原）。在 LAB 中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素 为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于 ELISA 中可使本底增高。从 链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在 ELISA 应用中有替代前者的 趋势。由于 ABS-ELISA 较普通 ELISA 多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中 ABS-ELISA 应用不多。
